低盐保温发酵对毛霉型豆豉品质的影响

梁 如，朱新鹏，李宏梁，黄 轩，崔荣荣，苏丹敏

（1.安康学院 现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000；2.安康市富硒食品技术研发中心，陕西 安康 725000；3．陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021）

1 前言

豆豉是以黄豆或黑豆为原料，经微生物作用而制成的一种具有特殊风味的调味品，并有悠久的制作和食用历史。豆豉酿造主要包括制曲和后发酵两个阶段，依据制曲中优势微生物种类，可分为米曲霉型、毛霉型、根霉型和细菌型[1]。豆豉不仅富含糖、蛋白质、多肽和氨基酸等多种营养物质，而且富含豆豉纤溶酶、类黑精和大豆异黄酮等多种生理活性物质，这些物质对预防疾病、降血压和抗自由基等有重要作用[2-6]。

食盐作为豆豉后发酵中的重要物质，用以抑制微生物过度繁殖，保证豆豉优良风味，但也使得成品豆豉中盐分含量过高，达10%～15%[7]。越来越多研究表明，高食盐摄入与高血压、心脏病和肝脏功能损伤有关，因此，低盐化发酵是我国传统发酵产品酿造的一个发展趋势和必然要求[8]。目前，关于低盐豆豉发酵的方法主要有以其他氯化物（KCl、MgCl2、MnCl2）和氨酸盐替代食盐进行减盐发酵、以香辛料替代部分食盐进行减盐发酵[9]。同时还可以采用微生物强化发酵[10]和提高发酵温度来抑制杂菌繁殖[11]。

发酵温度是影响豆豉和酱油等发酵食品后熟和品质的重要因素，目前，豆豉和酱油的生产过程中主要依赖环境温度[12]，在以小作坊式生产的企业中更是如此。随着传统食品酿造企业机械化和规模化发展，温度控制和调控相对来说越来越容易。本研究结合已有的研究结果[13-14]，研究保温（40℃）、低盐（9%）发酵条件对毛霉型豆豉的理化指标、游离氨基酸、蛋白酶活力和挥发性组分的影响，并与自然发酵豆豉样品品质进行比较，以期为豆豉酿造机械化和规模化生产提供一定的理论支撑。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 菌种：毛霉（Actinomucor elegans）。分离自成熟良好的豆豉曲，运用形态学、生理生化和26S rDNA和ITS方法鉴定，并以斜面培养物方式低温保藏，每4个月转接一次。

2.1.2 培养基：毛霉试管斜面培养基。选取麦芽汁培养基，用于制作斜面培养基和菌株的保存。毛霉种曲培养基和种曲制作方法参考何桂强等[15]描述的方法。

2.2 实验方法

2.2.1 工艺过程

参考张宇昊等[16]的豆豉生产工艺流程，如图1所示。具体方法为：（1）取自制成熟毛霉豆豉曲5kg，拌入9%盐分置于40℃条件下保温发酵的豆豉作为低盐发酵组，记为9#样品；（2）将按照传统工艺拌入13%盐分置于40℃条件下保温发酵的豆豉作为对照发酵组，记为13#样品；（3）将按照传统工艺拌入13%盐分置于自然温度发酵的豆豉记为13#-T。每个处理做三个平行，分别取三个平行样品，混合均匀后，置于-18℃保存，用于指标测定。

图1 豆豉生产工艺流程

2.2.2 蛋白酶活力测定

采用福林酚法测定豆豉后发酵过程中蛋白酶活力的变化，具体方法参照GB/T 23527—2009进行。

2.2.3 理化指标测定

总酸（TA）、氨基态氮（AN）、还原糖（RS）测定：采用滴定法测定样品中TA（以乳酸计）、AN 的含量[17]、RS 的含量[18]。

2.2.4 游离氨基酸（FAA）测定

参考崔瑞迎等[19]所述方法，用氨基酸自动分析仪检测豆豉样品中FAA。具体方法如下：精确称取样品5.00g，加入蒸馏水研磨后，转移至50mL容量瓶中，定容至50mL，取10mL滤液，加5mL 10%三氯乙酸溶液，室温静置提取2h，离心（10000×g，4℃）10min，上清液经0.45mm滤膜过滤并适当稀释后，用自动氨基酸检测仪（A300，membracePure GmbH，德国）检测FAA的含量。

2.2.5 挥发性组分测定

参考何桂强等[15]描述的方法，用顶空固相萃取—气相色谱—质谱联用法（HS-SPME-GC-MS）检测豆豉样品中挥发性组分。操作步骤：精确称取2.00g豆豉样品于顶空瓶中，加入内标2-辛醇（99mg/L）和辛酸甲酯（23mg/L，Sigma-aldrich，St.louis，MO，USA）各10μ m，60℃条件下平衡15min，插入固相微萃取头（CAR/PDMS/DVB，50/30μm，Supelco，USA），萃取45min。在GC进样口中解吸3min，检测其挥发性组分。色谱条件：色谱柱为HP-INNOWAX毛细管色谱柱（30.0 m×0.32mm×0.25μm，Agilent，USA）；升温程序：40℃保持5 min，然后以4℃/min升至100℃，再以6℃/min升至230℃，保持10min，进样口温度250℃；以高纯氦气为载气，流速1.0mL/min；离子源温度和连接线温度分别为230℃和250℃；EI电子能量为70eV；质量扫描范围为35～400amu。通过待测样品组分质谱数据与标准谱库（NIST2005）比对，匹配度大于800（最大为1000）的物质予以报道，采用内标法对样品中各检出物质进行半定量计算。

3 结果与讨论

3.1 盐分对保温发酵过程中蛋白酶活力的影响

图2为蛋白酶活力在保温发酵过程中的变化趋势。由图2可知，发酵过程中蛋白酶活力呈现持续降低的变化趋势，且低盐样品的降速低于高盐样品，说明盐分抑制了酶的活性。这与周涛等[9]研究的结果一致。豆豉后发酵过程中蛋白酶水解蛋白质形成短肽，赋予了豆豉降血压、抗氧化等多种保健功能，同时多肽进一步水解为游离氨基酸，由此可推测低盐发酵豆豉样品9#的氨基态氮和游离氨基酸含量均高于13#样品。

图2 保温发酵过程中蛋白酶活力的变化

3.2 盐分对保温发酵过程中理化指标的影响

下页图3a、3b、3c分别为保温发酵过程中还原糖（RS）、氨基态氮（AN）和总酸（TA）的变化趋势。图3显示，整个发酵过程中，RS、AN和TA在9#样品中的含量均高于在13#样品中的含量。豆豉样品中还原糖的变化受淀粉酶水解淀粉形成葡萄糖等单糖速率与微生物消耗葡萄糖等单糖速率的影响，图3a显示，在发酵前期10天，生成速率高于消耗速率，因此RS含量增加，而随发酵时间进行，淀粉酶活力受盐影响降低，还原糖生成速率降低，而由于微生物生长，消耗速率增加，因此表现为还原糖含量降低。豆豉中微生物代谢糖类等物质形成乳酸和乙酸等有机酸，低盐条件下微生物生长受盐分影响较小，因此，9#样品中总酸含量高于13#样品总酸含量，这也与发酵后期RS快速降低的变化趋势相一致。图3b显示，9#样品中AN的含量高于13#样品中AN的含量，与其对应样品中蛋白酶活力的变化趋势一致。

图3 保温发酵过程中RS（a）、AN（b）和TA（c）的变化

3.3 低盐发酵对游离氨基酸的影响

游离氨基酸（FAA）既是风味物质，又是风味前体物物质，对豆豉特征风味的形成具有重要作用[20]。因此，考察和检测游离氨基酸含量的变化对豆豉发酵工艺改进和提升产品质量有重要意义。下页表1为三种类型豆豉样品中FAAs的组成和含量，共检出了18种FAAs，其中人体必需的氨基酸7种。9#样品中FAAs总含量最高，其次为保温发酵的13#样品，而13#-T样品中含量最低，此结果与蛋白酶活力和氨基的辩护一致，这是由于升高温度加快了酶促反应速率，使得相同时间内游离氨基酸生成量增加，同时，由于9#样品中盐分低，酶失活速率减小（见图2），进一步增加了FAA生成，因此，在低盐保温发酵豆豉样品中FAA总含量最高。色氨酸仅在保温发酵的两个豆豉样品中检出，而天门冬酰胺仅在常温发酵的13#-T样品中检出。其余各种FAA在各样品中的含量与总FAA的含量变化差异一致。优势氨基酸为谷氨酸，这是一种重要的鲜味氨基酸，与NaCl协同作用时，降低鲜味阈值，使产品鲜味更浓郁[21-22]。实验结果表明，低盐保温发酵促进了蛋白质水解，提升了豆豉产品的鲜味。

3.4 低盐保温发酵对挥发性组分的影响

采用HS-SPME-GC-MS对三类样品中挥发性组分分析，三类样品中共检出醇类（6），酸类（3），酯类 （22），杂环类 （10），烃类 （6），醛类（6），酚类（7）和其他类（3）共八类64种挥发性组分。其中，酯类组分数量最多，共22种，含量占检出挥发性组分总含量的22%～35%（见图4）。各样品中检出的挥发性组分数量有差异，9#、13#和13#-T样品分别检出了62种、63种和55种挥发性组分。挥发性组分总含量表现为：保温发酵样品高于自然发酵样品，低盐保温发酵9#样品略高于13#样品（见下页图5）。由图4还可以知道，酸类组分、酯类组分和醛类组分为优势挥发性组分，占检出挥发性组分总含量的74%～88%。其中酯类组分在9#样品中占比最大，为35%，酸类组分在13#样品中占比最大，为43%，而醛类组分在13#-T样品中占比最大，为38%。由此可知，发酵温度和盐分对挥发性组分的形成具有重要影响。

图4 不同样品中各类挥发性组分所占百分比

表1 不同样品中游离氨基酸含量比较

图5 不同样品中挥发性组分总含量

酯类组分主要由酵母菌代谢或醇和酸酯化产生[23]。短链脂肪酸酯，如辛酸乙酯、己酸乙酯和庚酸乙酯，能赋予其水果的芳香，且对缓解胺类和脂肪酸的刺激性和苦味有重要贡献[24-25]。对下页表2中的9#与13#样品中挥发性组分的含量进行比较可知，低盐保温发酵有利于对产品风味贡献大的酯类组分积累，其中，酯类组分中对酯类组分含量贡献大的辛酸乙酯和棕榈酸乙酯的含量表现为：9#样品高于13#样品。另外，苯甲酸乙酯、月桂酸甲酯、棕榈酸甲酯和9-十六碳烯酸乙酯的含量表现为：9#样品均高于13#样品。对13#与13#-T样品中的挥发性组分含量进行比较可知，保温发酵使豆豉样品中酯类组分数量增加，与13#-T相比，13#样品中检出的酯类组分增加了6种，分别是己酸乙酯、庚酸乙酯、己酸丁酯、丁酸己酯、己酸异戊酯、己酸己酯、乙酸-2-苯基乙酯、肉豆蔻酸甲酯和肉豆蔻酸乙酯。对于优势酯类组分辛酸乙酯和棕榈酸乙酯而言，辛酸乙酯在13#样品中的含量是13#-T样品含量的5.9倍，而棕榈酸乙酯含量表现为：13#-T样品高于13#样品。其次，油酸乙酯和亚油酸乙酯则在三个样品中的含量差异不大。

三个样品中检出的酸类组分总含量表现为：低盐样品9#低于高盐样品13#，且13#-T样品中含量最低，同时数量最少。但由于酸类物质的阈值较高，所以对产品的风味贡献不大。酸类组分中，乙酸为优势酸类组分，乙酸主要源于微生物的代谢[26]。

表2 不同样品中挥发性组分含量比较

续表

醛类挥发性组分主要是通过氨基酸降解[27]、脂质氧化[28]、脂肪酸氧化以和脱羧[29]以及微生物代谢的产物途径形成[27]。醛类组分含量约占挥发组分总含量的19%～38%。大部分醛类挥发性物质的风味阈值相对较低，因而醛类挥发性物质对豆豉风味的贡献相对较大。大多数的醛类物质呈现较强的香气，如油脂味、甜香味、青草味、花香味及香草味等[30]，优势组分包括苯甲醛、苯乙醛和可卡醛。其中，苯甲醛在两个保温样品中含量相当，且都高于自然发酵样品13#-T，而苯乙醛和可卡醛含量则表现为：两个保温样品低于自然发酵样品13#-T。

杂环类挥发性组分和酚类组分在豆豉样品中含量也比较高（见表2和图4），且这两类挥发性组分在13#-T中的含量高于在9#和13#中的含量。其中，优势组分为2-乙酰吡咯、3-苯基呋喃和2-硝基苯酚，且它们在13#-T中的含量高于在9#和13#中的含量。2-乙酰吡咯是一种具有爆米花香气的物质，是脯氨酸和单糖经美拉德反应产物[31]，其在13#-T样品中的含量远高于在9#和13#样品中的含量，13#-T中的含量约是13#含量的5倍，是9#含量的5.8倍。

烃类物质是由脂肪酸在酶或非酶氧化作用下形成的一类化合物，由于烃类化合物的风味阈值较高[32]，且在样品中含量较低（见表2），因此检出的烃类组分对风味没有实际贡献，这里不做讨论。

对于醇类组分而言，3-甲基丁醇，3-甲硫基-1-丙醇在9#样品中的含量要高于在13#和13#-T样品中的含量。醇类组分主要通过羧基还原和不饱和脂肪酸降解等途径形成[27-29,33]。在40℃条件下发酵，酵母菌等微生物难以生长。本实验过程中，对自然发酵豆豉而言，由于温度低和发酵时间短，故样品中醇类组分含量也比较低。9#样品由于盐分低，对酵母菌抑制性弱，相对而言，其醇类组分含量高于13#样品。同时，由于醇类组分的风味阈值也较高，含量较低（见表2），对豆豉风味影响不大。

检出的其他类组分总含量表现为：保温发酵产品要明显高于自然发酵样品，其中以2-甲基-3-甲氧基-4-吡喃酮含量变化最为明显。

综上所述，对不同发酵方式豆豉样品中挥发性组分比较可知，酯类和醛类组分对豆豉风味组分影响较大，低盐保温发酵提高了酯类组分的含量，特别是具有水果香味的辛酸乙酯，在低盐保温发酵样品中的含量远高于其余两个样品（见表2）。而醛类组分的含量则表现为：保温发酵样品低于自然发酵样品。其中苯乙醛和可卡醛含量在保温和非保温样品中差异最为显著。

4 结论

本文以毛霉型豆豉为研究对象，通过比较低盐保温发酵条件下豆豉的理化指标、蛋白酶活力、游离氨基酸和挥发性组分的差异，研究了低盐保温发酵对毛霉豆豉品质的影响。结果显示：盐分影响了蛋白酶活力，从而影响最终产品中氨基态氮和游离氨基酸的含量，低盐保温发酵增加了豆豉样品中总酸、氨基态氮和游离氨基酸的含量；适当降低盐分，提高发酵温度，能促进豆豉样品中挥发性组分积累，特别是酯类组分积累，说明低盐保温发酵方式用于豆豉发酵是可行的。此外，保温发酵使豆豉样品的醇类挥发性组分降低而使酸类挥发性组分升高，这可能是高温发酵影响了豆豉后发酵过程中微生物的演替和变化，其具体原因尚需要进一步研究，以期为指导豆豉工业化和规模化生产提供更多的理论支撑。