大鼠输卵管炎性模型的建立及技术改进

周波文，王 鑫，王俊衡，潘德树，缪嗣延，陈张伟，邢 越，胡 琦，杨粤军

（1.湖南师范大学树达学院，长沙 410013；2.湖南师范大学医学院，长沙 410013）

输卵管炎是妇科的常见病。随着输卵管炎性阻塞发病的增加，其主要并发症"不孕"导致家庭和社会问题随之增多，大鼠输卵管炎症模型作为研究女性不孕症状治疗的重要载体，还可作为研究大鼠输卵管炎症病理生理机制的模型。根据国内外研究动态［1-8］，输卵管炎病理机制及治疗手段一直是各研究领域的热点和难点。因此，经大鼠阴道注菌法操作，用塑胶巴氏滴管吸取混合菌，从阴道-子宫-子宫底注射细菌，此操作方便简便。用此方法建立一个稳定的输卵管炎动物模型对于治疗该疾病以及在今后的实验应用上具有重大的意义。赵广兴大鼠混合菌株接种法［9］：腹腔注射麻醉，打开腹腔，于子宫靠近输卵管处向两侧输卵管分别注入混合菌液，逐层缝合，关腹。此操作难度大，无菌环境条件要求高，并容易引起并发感染。所以大鼠阴道注菌法操作更加简便，且能建立一种稳定可靠的大鼠输卵管炎模型，并贴近临床病理模型。

1 材料与方法

1.1 混合细菌混合细菌（大肠埃细菌：肠球菌：白色假丝酵母菌按2：1：1用无菌生理盐水混合配成3×109cfu/mL）。

1.2 材料

1.2.1 实验动物SPF级7周龄SD雌大鼠60只，体重（185±15）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供（许可证号：SCXK（湘）2016-0002）。大鼠进行分笼饲养，每笼5只，由湖南师范大学医学院动物房饲养（许可证号：SYXK（湘）2019-0008）。

1.2.2 实验器材使用塑胶巴氏滴管（海门市远博实验器材，中国）、混合菌种、固体琼脂培养基、恒温培养箱、生物安全柜等（由湖南师范大学医学院提供）。

1.3 实验方法

1.3.1 注菌操作实验组10只大鼠进行外阴道注菌法处理：将SD雌大鼠倒立，暴露外阴，用碘伏消毒外阴，用塑胶巴氏滴管吸取0.1mL混合菌液，从外阴道插入，直至子宫底后注射菌液，为了防止菌液逸出，保持倒立3min左右，让混合菌液流入输卵管。对照组不做任何处理。

1.3.2 模型检测分别在实验开始后第5、10、15、20天随机选择实验组两只大鼠进行取组织观察输卵管的形态结构变化，并拍照记录。用剪刀剪开输卵管的一侧，用无菌羊肉汤湿润的医用棉签在剪开的输卵管处刮取输卵管黏液，并在输卵管各个部分都分别进行刮取。将刮取后的棉签及时送进微生物实验室进行细菌培养，用棉签走“Z”字形，将刮取的黏液涂满固体琼脂培养基，在恒温培养箱中培养24小时。

1.3.3 病理检测将输卵管制作成切片，在显微镜下进行观察。HE染色步骤如下：固定：福尔马林浸泡2h。脱水：75%酒精1.5h、80%酒精1.5h、90%酒精1h。透明：无水酒精1h、无水酒精1h、无水酒精0.75h、松节油Ⅰ、Ⅱ都为0.75h。脱蜡：二甲苯10min、无水酒精10min、95%酒精10min、85%酒精10min、75%酒精10min、蒸馏水10min、自来水洗片5min。染色：苏木素染色2min、自来水洗片5min、盐酸分化液1s、自来水洗片5min、返蓝液30min、伊红5min、自来水洗片5min。脱水、透明、封片：蒸馏水3min、75%酒精3min、85%酒精3min、95%酒精3min、无水酒精3min、二甲苯3min、中性树胶封片。

1.4 主要观察指标（1）对比实验不同阶段大鼠输卵管形态；（2）苏木素-伊红染色结果；（3）输卵管黏膜分泌物细菌培养。

2 结果

2.1 形态观察分析每组输卵管通过肉眼观察，比较实验组与对照组输卵管的形态。不同组输卵管形态对比见表1。

表1 不同组输卵管解剖组织形态比较

2.2 显微镜下SD大鼠输卵管病理切片观察病理组织学变化分析：注射细菌后第5天，输卵管的粘膜层有大量炎细胞浸润，可见炎细胞浸润黏膜全层，有向肌层浸润的趋势，肌层未累及。注射细菌后第10天，黏膜层浸润的炎细胞开始集中于黏膜层和肌层的交界处，呈长条状弥散分布，并可见有少量炎细胞浸润肌层，平滑肌细胞间可见单个或多个炎细胞浸润。但浆膜层未累及。注射细菌后第15天，炎细胞仍浸润粘膜层全层，并且浸润肌层炎细胞增多，呈长条状分布于平滑肌细胞间。仍未累及浆膜层。注菌后第20天，炎细胞已经可以在黏膜层、肌层、浆膜层发现，平且呈弥散，长条状分布，数量多。对照组粘膜层、肌层、浆膜层均未见明显的炎细胞浸润，组织结构清楚，结果见图1。

图1 显微镜下SD大鼠输卵管病理切片（×400，HE染色）

2.3 黏液细菌培养结果对照组：因SD大鼠阴道内存在正常菌群，培养基也可见大小不等小菌落，多接近圆形，表面光滑，隆起，黄色，整个培养基透明。实验组注菌后第十五天细菌培养出现大小不等的小菌落和较大菌落，小菌落颜色为黄色，隆起，湿润，菌种较实验组数量明显增多。整个培养基不透明，分布更加致密。

3 讨论

输卵管炎作为一种常见妇科疾病，可造成输卵管壁粘连阻塞，进而导致不孕症，因此建立一个稳定的输卵管炎动物模型对于治疗该疾病以及在今后的实验应用上具有重大的意义。传统的建立输卵管炎模型的方法，如赵广兴等学者的“混合菌株接种法”［9-12］：打开腹腔，沿子宫找输卵管，再沿着输卵管-卵巢方向注射混合菌液造成大鼠输卵管炎症。该造模方法沿用至今，但是该方法对动物的损伤较大，暴露腹腔会造成其他炎症感染或手术并发症，出现动物死亡，影响造模率，并且对实验无菌环境要求严格。

赵广兴等学者［9-12］选用的混合菌液（大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，溶血性链球菌=2：1：1）用无菌生理盐水配成浓度约为3×109cfu/mL。 在注菌一周内有部分大鼠因急性感染死亡。其余大鼠输卵管出现与周围组织黏连，个别出现积水或积脓。胡喜娇等［13］使用的是金黄色葡萄球菌用生理盐水配成浓度为4×109cfu/mL的致病菌悬液。注菌后出现了大鼠输卵管的积水积脓，注菌时间越长，不仅是输卵管及卵巢包膜内积水积脓，盆腔粘连，而且腹腔各器官形态也发生严重变形。本次实验使用的混合菌液（大肠埃希菌，肠球菌［14］，白色假丝酵母菌［15］=2：1：1混合配成浓度约为3×109cfu/mL）在注菌后发现大鼠输卵管出现了水肿，弹性变差，管径大小不一。没有出现积水积脓及组织黏连，但在病理图上有明显的炎细胞浸润。此方法没有造成实验动物急性死亡，且更贴近临床常见感染炎症的途径［16］，为以后研究人类输卵管炎提供了可靠的病理模型。

李楠、刘丽教授对阴道介入法与开腹接种法进行了对比研究［17］参考可得，阴道介入法可以一定程度评价输卵管炎模型，但效果不如传统造模，这是由于子宫输卵管开口处细胞组织具有先天免疫功能，可有效阻止病原体逆行感染，是人为不可控的干扰因素，这也是本次造模方法均没有出现组织粘连，脓液渗出的现象，但此造模方法更贴近临床常见病理模型。

本次实验方法是用巴氏吸管吸取菌液从大鼠的阴道注入大鼠体内，本方案没有开腹等复杂操作，避免了一些不确定因素，即阴道注射法比传统造模方法更加省时省力，技术难度低，更易操作，也不会引起对实验无关的并发感染，且建模效果佳。

大鼠混合菌阴道接建立输卵管炎模型的炎症程度不及传统造模方法明显，但此方法操作简单方便，模型更加稳定可靠，贴近临床病理所见。