八味秦皮丸指纹图谱及质量可控性研究

海馨月 黄小清 覃媛媛 李 娇 戴荧博 韩泳平

西南民族大学药学院，四川 成都 610041

藏医药是祖国医学宝库中的瑰宝，但因历史局限性，传统藏药还存在剂型不太合理、质量标准水平较低、安全性和有效性难以保障等问题[1]。八味秦皮丸由秦皮、针铁矿、草莓、多刺绿绒蒿、寒水石(制)、美丽风毛菊、朱砂、麝香等组成，为藏药常用处方，具有接骨、消炎、止痛的功效，用于骨折、骨髓炎[2-3]。其现行质量标准中仅有理化和薄层鉴别，缺乏指标性成分的定量测定，难以有效地综合评价其内在质量。秦皮为本方中主药，现代研究证明，秦皮中的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素，具有明显的抗炎镇痛作用[4-7]。麝香对非特异性炎症亦具有显著抗炎效果。

实验采用高效液相色谱法对该复方制剂多个厂家、多个批次样品的指纹图谱进行分析，为该制剂科学合理的质量控制标准的建立提供了一定的依据[8-12]。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Essentia LC-16型高效液相色谱仪；SPD-16高效液相紫外-可见检测器； METTLER TOLEDO AE240电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 八味秦皮丸(0.25 g每丸，西藏甘露藏药股份有限公司，产品批号：12214A、12220A、12226A、12238A、12247A、12255A、12265A、12277A、12280A、12287A、12293A、12298A)，甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC指纹图谱的建立

2.1.1 HPLC色谱条件 色谱柱：Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：甲醇-水溶液，以表1中梯度洗脱条件洗脱；体积流量：1.0 mL/min；柱温：室温；检测波长：254 nm。

表1 梯度洗脱表

2.1.2 供试品溶液的制备 取样品精密称量1.25 g，研匀成细粉，置于50 mL圆底烧瓶中，精密量取并加入甲醇25 mL，密塞，称定质量并记录，于水浴上加热回流30 min，冷水浸泡放冷，称定质量并记录，用纯甲醇补足减失的质量，充分摇匀，抽滤，取上层续滤液再次进行精密过滤，得淡黄色溶液作为HPLC测定样品溶液[7]。

2.2 八味秦皮丸指纹图谱的建立 取12批八味秦皮丸样品，按“1.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行进样分析，得到八味秦皮丸的指纹图谱(如图1所示)，并采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版软件对12 批样品的指纹图谱进行分析，以S5号样品的图谱为对照指纹图谱(如图2所示)，采用平均数相关系数法对各指纹图谱色谱峰进行了多点校正和自动匹配，其中共有色谱峰25个，以出峰稳定，峰面积较大的6号色谱峰为参照峰，然后进行了相似度计算，12批八味秦皮丸指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0. 95(表2)[8-9]。

图1 八味秦皮丸的指纹图谱

表2 相似度评价结果

续表2

图2 对照图谱

图3 样品聚类分析图

2.3 八味秦皮丸指纹图谱聚类分析 以12批样品的25个明显的共有色谱峰面积为指标，运用SPSS19.0统计分析软件，进行聚类分析[10]。采用Ward法，平方Euclidean距离度量标准进行聚类分析，聚类结果如图3所示。可以看出，12批样品可以分为2类: S1、S2、S3、S5 号样品为一类，剩余8批样品为一类。原因可能是八味秦皮丸原料年份不同导致的差异。

2.4 八味秦皮丸指纹图谱主成分分析(PCA) 应用 SPSS 统计分析软件对12批八味秦皮丸进行了PCA[11]，即将它们投影至低维空间来看它们之间的微细差别，先将原始数据矩阵经标准化处理，再对其进行运算。由表3看出，当特征值>1时，共提取到6个主成分。

表3 特征值与贡献率

通过 SPSS 统计分析软件计算出主成分矩阵，见表4。从表中可以看出14、20、23号色谱峰在主成分1中有明显的负相关趋势，表明其增加，第一主成分减少；8、9、10、12、13、16、22号色谱峰在第一主成分中有明显的正相关趋势，表明其增加，第一主成分增加，其他的色谱峰对第一主成分影响相对较小。6、15号色谱峰在主成分2中有明显的负相关趋势，表明其增加，第二主成分减少；4、11、20号色谱峰在主成分2中有明显的正相关趋势，表明其增加，第二主成分增加，其他的色谱峰对第二主成分影响相对较小。5、18、21、23号色谱峰在主成分3中有明显的正相关趋势，表明其增加，第三主成分增加；14、24、25号色谱峰有明显的负相关趋势，表明其增加，第三主成分减少，其他的色谱峰对第三主成分影响相对较小。5号色谱峰在主成分4中有明显的正相关趋势，表明其增加，第四主成分增大；18号色谱峰在主成分4中有明显的负相关趋势，表明其增加，第四主成分减少，其他的色谱峰对第四主成分影响相对较小。4号色谱峰在主成分5中有明显的正相关趋势，表明其增加，第五主成分增大；15号色谱峰在主成分5中有明显的负相关趋势，表明其增加，第五主成分减少，其他的色谱峰对第五主成分影响相对较小。 6、14、18、24号色谱峰在主成分6中有明显的正相关趋势，表明其增加，第六主成分增大；25号色谱峰在主成分6中有明显的负相关趋势，表明其增加，第六主成分减少，其他的色谱峰对第六主成分影响相对较小。

表4 主成分矩阵

续表4

对主成分矩阵数据进行 PCA 后，以主成分1和主成分2建立坐标系即得所有样本的 PCA 平面得分图(如图4所示)，样本的内在相互关系可较好地表现出来进而实现样品之间的分类，从图中可以看出八味秦皮丸分为两类，其结果与聚类分析结果一致[12]。

图4 主成分平面得分图

3 讨论

3.1 检测波长的选择 本实验曾按照文献[4]，选用甲醇-水体系为流动相，检测波长为344 nm，但在此条件下出峰太少不利于指纹图谱研究；检测波长为254 nm时出峰较多，有利于开展指纹图谱研究。

3.2 梯度的选择 取同一供试品试液，分别考察色谱峰的分离效果。在多个梯度洗脱条件中，发现只有在表1梯度洗脱条件下，样品图谱基线较平稳，色谱峰峰形良好，各峰之间分离度较好。因此选择表1中的梯度条件进行洗脱。

3.3 柱温的选择 取同一供试品溶液，在不同的色谱柱温度下(18 ℃、室温、30 ℃)，考察温度对色谱峰分离情况的影响。结果表明，温度对各峰的分离效果影响不大，考虑到采用室温较简便，因此最终确定测定用柱温为室温。

4 结论

通过指纹图谱相似度评价软件建立了12批八味秦皮丸指纹图谱的共有模式，确认了25个共有峰，不同样品之间的相似度均大于0.909，表明不同批次八味秦皮丸的质量的一致性良好。聚类分析和PCA结果显示，12个批次样品可分为2类，这可能与药品的储存条件和时间相关。HPLC指纹图谱法评价八味秦皮丸质量的方法通过了方法学验证，实验结果表明，方法准确、简便、重现性良好，能够为本品的质量控制提供方法学基础。