干旱胁迫下PGPR对红枣植株生长及生理特性的影响

张 敏 王 迎 杨 琳 郝汝倩 白晓雄 余 旋

( 1. 西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100；2. 国家林业局黄土高原林木培育重点实验室，陕西 杨凌 712100；3. 陕西省林业综合重点实验室，陕西 杨凌 712100)

受全球气候变化和人类活动的影响，干旱成为制约农林业生产的主要因素[1]。在干旱半干旱地区，大多数水果作物经常处于缺水状态，严重影响了果树的生长、果实的产量和品质。然而，灌溉和选育耐旱品种等传统的抗旱措施费时费力，因此在干旱半干旱地区如何才能使植物更好地应对干旱环境，成为人们关注的热点。

植物根际促生细菌（PGPR）是指生存在植物根圈范围内，可促进植物生长、拮抗病原菌的一类有益细菌[2]。在干旱胁迫下，PGPR可促进植物生长，增加干物质积累，修复干旱胁迫对植物的危害[3-4]。其缓解干旱胁迫的机制如下：1）改变植物激素的浓度或产生植物激素；2）溶解矿物磷质和其他营养素；3）诱导作物产生系统抗性等[3,5-6]。目前大量研究表明，芽孢杆菌属（Pseudomonas）和假单胞菌属（Bacillus）PGPR可提高植物抗逆性[7-8]。然而，对PGPR缓解干旱胁迫的研究，多以农作物为接种对象，且集中在对株高和生物量的影响上[9-10]。以木本植物作为接种对象，研究PGPR缓解干旱胁迫的报道相对较少[11-12]。

红枣（Zizyphus jujuba）作为我国重要经济林木之一，因其果实的营养保健功能越来越受到重视，枣树主要分布在我国干旱和半干旱地区[13]。近年来，随着全球气候变暖，干旱和半干旱地区也出现了严重的缺水，土壤含水量为3%～36%[14-15]。孙浩元等[16]研究显示，当土壤含水量达到3%时，枣苗会永久萎蔫；在果实硬核后的缓慢生长期，当田间持水量处于30%～50%时，红枣果肉细胞生长停止，导致枣果变小引发的减产。艾鹏睿等[17]研究表明，灰枣产量在重度水分亏缺时较充分灌溉处理减产18%。因此，干旱成为制约我国干旱半干旱地区红枣产业发展的重要因素[18]。目前，生产上主要通过施用保水剂、覆盖薄膜抑制蒸发和选育抗旱品种的方法，来缓解干旱胁迫对植物的危害[19-21]，但传统的抗旱措施成本高、耗时耗力。因此，本研究拟采用盆栽试验，以1年生红枣植株为供试材料，探索不同干旱胁迫程度下PGPR对红枣植株生长及生理特性的影响，旨在为旱地红枣种植以及促生菌资源的开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试植株为红枣（Zizyphus jujuba）品种“七月鲜”1年生嫁接苗，由西北农林科技大学清涧红枣试验站提供。

供试菌株为红枣根际促生细菌Pseudomonas koreensis和Bacillus filamentosus，由作者前期从干旱半干旱地区红枣植株根际土壤分离获得。2株菌株均具有分泌ACC脱氨酶、产胞外多糖、固氮和解磷的能力。P. koreensis和B. filamentosus均具有一定的抗旱能力，能在水势为−0.30 MPa中存活。前期的定殖试验结果表明，这2株菌株均能在土壤中定殖。接种到土壤中90 d后菌群数量趋于稳定，分别为4.69×106cfu/mL和4.24×106cfu/mL。

供试土壤采自西北农林科技大学渭河试验林场。采样深度为0～20 cm，土壤质地为沙壤土，土壤理化性质为：有机质11.25 g/kg，全氮0.84 g/kg，全磷0.32 g/kg，碱解氮47.80 mg/kg，速效磷3.60 mg/kg，速效钾42.15 mg/kg。样土风干经0.1%（占干质量）的甲醛溶液熏蒸灭菌后过1 mm筛，并与过1 mm筛的河沙以体积比3∶1混匀后备用。

1.2 试验设计

盆栽试验采用双因素随机区组设计，因素A为菌剂，因素B为水分胁迫。因素A菌剂设4个处理：1）接种P. koreensis菌剂150 mL（T1）；2）接种B. filamentosus菌剂150 mL（T2）；3）接种混合菌剂（V（T1）∶V（T2）=1∶1）150 mL（T3）；4）接种无菌的空白LB液体培养基150 mL为对照（ck）。因素B水分胁迫参照前人对红枣植株干旱耐受性研究[22-23]和预备试验，分为4个水平：无水分胁迫（ND，田间持水量的65%～70%）、轻度水分胁迫（LD，田间持水量的50%～55%）、中度水分胁迫（MD，田间持水量的35%～40%）、重度水分胁迫（SD，田间持水量的20%～25%）。试验共计16种处理，每个处理重复10次，共160盆。

本试验于2018年5月起，在西北农林科技大学有防雨棚的林木育苗苗圃进行。选取长势一致的1年生红枣植株定植于18 cm×25 cm（高×口径）且装有5 kg无菌土的花盆中。定植时每盆均按N 300 mg/kg、P2O5300 mg/kg、K2O 300 mg/kg施入氮肥（尿素）、磷肥（磷酸二氢钾）和钾肥（硝酸钾）。

待植株移栽成活后，立即在其根际周围用无菌注射器注射浓度为108cfu/mL的各处理菌剂150 mL，对照组注射空白LB液体培养基150 mL。在接菌7 d后，进行干旱胁迫，并持续胁迫10 d。期间为了使各干旱处理组的土壤含水量接近目标值，每天对花盆进行两次称量，并根据需要浇水[24]。选择晴天上午9：00—11：00测定植株光合作用。待胁迫完成后，每个处理取5株试验苗，将其全部收获后，测量植株株高和生物量；另外，每个处理取5株植株，选取相同位置的功能叶片，测定生理生化指标。

1.3 测定方法

株高采用卷尺测量，生物量烘干后采用称重法测定，叶片相对水分含量根据李合生[25]的方法测定，光合作用参数（净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度）用Li-6400便携式光合系统测定仪测定，叶绿素含量采用分光光度法测定，过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）法测定，脯氨酸（Pro）含量采用茚三酮显色法测定，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定，植株叶片IAA和ABA激素含量采用酶联免疫吸附法测定（Phytodetek-IAA和Phytodetek-ABA检测试剂盒，美国Agdia公司），每个样品重复5次，取其平均值。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0软件对数据进行单因素（one-way ANOVA）方差分析和多重比较（LSD法，α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下PGPR对植株生长特性及叶片相对水分含量的影响

如图1所示，中、重度水分胁迫显著影响红枣苗木的生长，地上部和地下部干物质的积累以及叶片相对水分含量（P＜0.05）。接种菌剂T1、T2或T3显著促进了干旱胁迫下红枣苗木的生长和叶片相对水分含量的提高（P＜0.05）。在不同干旱胁迫程度下，各接菌处理组株高、地上、地下部干质量和叶片相对水分含量均较对照（ck）显著增加（P＜0.05），且增加幅度随干旱胁迫程度的加剧而增加。在重度水分胁迫下，除T2处理组的地下部干质量和T1、T2处理组的叶片相对水分含量显著低于无水分胁迫的对照组外（P＜0.05），其他处理组的地上、下部干质量和T1、T2处理组的株高均与无水分胁迫的对照组无差异，且T3处理组的株高和叶片相对水分含量均显著高于无水分胁迫的对照组（P＜0.05）。其中各菌剂接种处理组中，以混合菌剂T3效果最佳，在中度水分胁迫下，植株株高、地上部、地下部干质量和叶片相对水分含量分别是其余处理组的1.12～1.68倍、1.10～1.48倍、1.10～1.35倍 和1.09～1.32倍。

2.2 干旱胁迫下PGPR对植株光合特性及叶绿素的影响

红枣叶片的气孔导度、净光合速率、胞间CO2浓度和叶绿素含量，均随干旱胁迫程度的增加而下降。但在干旱胁迫下，接种T1、T2或T3菌剂植株的上述各项光合指标和叶绿素含量，均高于对照处理组植株。由图2a、b、d可见，接种各菌剂处理后，植株气孔导度、净光合速率和叶绿素含量在中、重度水分胁迫条件下，均显著高于对照（P＜0.05）。其中，中、重度水分胁迫下，各菌剂处理组植株的净光合速率平均值、气孔导度平均值和叶绿素含量平均值，分别较对照增加了69.4%、52.4%和39.8%。而对于植株胞间CO2浓度，只有重度水分胁迫下的T3菌剂处理组显著高于对照（P＜0.05，图2c）。同时在这4种水分处理中，混合菌剂T3处理组苗木的净光合速率、气孔导度和叶绿素含量均高于其他处理组，且部分达到显著水平（P＜0.05）。

图 1 不同干旱胁迫下T1、T2和T3对红枣植株生长的影响Fig. 1 Effects of T1, T2 and T3 on plant growth of Z. jujuba seedlings under different drought stress

图 2 不同干旱胁迫下T1、T2和T3对红枣叶片叶绿素含量及光合特性的影响Fig. 2 Effects of T1, T2 and T3 on plant chlorophyll content and photosynthetic characteristics of Z. jujuba leaves under different drought stress

2.3 干旱胁迫下PGPR对植株生理生化特性的影响

由图3a、b、c可知，无论是否接种PGPR菌剂，红枣叶片内过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和脯氨酸（Pro）含量均随干旱强度的增加，呈逐渐上升趋势。各接菌处理组的增加幅度均高于对照处理组，且随干旱胁迫程度的加剧具有显著性差异（P＜0.05）。在重度干旱胁迫下，各菌剂处理组叶片中POD、SOD和Pro含量较对照分别增加22.0%～39.4%、19.5%～30.5%和14.0%～17.7%。同时，接种菌剂还会降低叶片内随干旱胁迫程度加剧而逐渐升高的丙二醛（MDA）含量，并且随胁迫程度的加剧各处理组显著低于对照组（P＜0.05）（图3d）。其中，重度干旱胁迫下接种T1、T2或T3菌剂，MDA含量较对照分别显著降低25.5%、20.9%和43.1%。各处理组中以混合菌剂T3的处理效果最佳，其叶片中MDA含量在各水分胁迫程度下，均能达到无水分胁迫对照处理的水平。

图 3 不同干旱胁迫下T1、T2和T3对红枣叶片脯氨酸含量及抗氧化酶活性的影响Fig. 3 Effects of T1, T2 and T3 on plant Pro content and antioxidant enzyme activity of Z. jujuba leaves under different drought stress

2.4 干旱胁迫下PGPR对红枣植株内源激素的影响

随着干旱胁迫程度的加剧，红枣叶片中吲哚乙酸（IAA）含量逐渐降低，脱落酸（ABA）含量逐渐增加。由图4a可知，在各干旱胁迫程度下，接菌处理组IAA含量均显著高于对照（ck）（P＜0.05）。在轻、中和重度水分胁迫下，其IAA含量的平均值分别是对照的1.48倍、1.42倍和1.77倍。相反，ABA含量在各干旱胁迫程度下接种菌剂后，均有不同程度的降低（图4b）。在中度和重度水分胁迫下同对照相比，接种T1和T3后ABA含量显著降低（P＜0.05），其在重度水分胁迫下较对照减少12.6%和21.3%。在各水分胁迫程度下，混菌T3处理组的IAA含量均为最高，ABA含量最低，且部分达到显著水平（P＜0.05）。

图 4 不同干旱胁迫下T1、T2和T3对红枣叶片激素含量的影响Fig. 4 Effects of T1, T2 and T3 on plant hormone content of Z. jujuba leaves under different drought stress

3 结论与讨论

干旱胁迫下，植物细胞中积累的胁迫乙烯会激活叶绿素酶基因，导致叶绿素分解，降低光合作用，影响植株根系和茎部生物量的积累[26]，并且叶片中的气孔往往也会部分或全部关闭，以降低蒸腾速率，这在减少水分散失的同时，也减少了CO2的进入，导致光合速率下降[27]。PGPR对植物生长具有显著的促进作用[28]。Sandhya等[29]研究表明，接种产胞外多糖的Pseudomonas putida可以提高土壤对水分的吸收。本研究在不同干旱胁迫程度下，接种具有固氮、解磷、分泌胞外多糖和产ACC脱氨酶活性的植物根际促生细菌P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌剂的结果表明，各接菌处理不仅能增加红枣植株的株高，地上、地下部干物质的积累和叶片相对水分含量，还能提高植株的气孔导度、净光合速率、胞间CO2浓度和叶绿素含量。由此说明，P.koreensis和B. filamentosus通过提高红枣植株对土壤水分和养分吸收的能力，增加叶片相对水分含量，缓解干旱胁迫，从而打开气孔增加光合速率，同时菌株产生的ACC脱氨酶可分解植株体内的胁迫乙烯，使得叶绿素不受损害，以保证红枣幼苗相对高效的光合作用，促进其生长。

干旱胁迫过程中，植物体内会积累大量活性氧自由基，来氧化膜脂肪酸中的不饱和键，形成丙二醛（MDA）[30]，对植物细胞造成损伤。随着干旱胁迫程度的增加，植株体内会产生一系列的抗氧化酶—过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等来清除多余的活性氧自由基[31-32]。Brilli等[7]在干旱胁迫的番茄（Solanum lycopersicum）植株中接种PGPR的结果显示，植物根际促生细菌Pseudomonas chlororaphis可通过提高叶片中SOD活性来消除MDA对番茄体细胞的影响，促进番茄植株生长。Sukkasem等[8]认为，在干旱胁迫下，接种Bacillus licheniformis菌剂可通过增加拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗内POD等抗氧化酶活性来消除体内的MDA，从而增加根毛数和鲜质量。本研究结果显示，随着干旱胁迫程度的加剧，尤其是在中、重度水分胁迫下，MDA含量显著高于对照，说明红枣植株体内的保护机制不足以应对中、重度水分胁迫。但是在接种菌株P. koreensis或B. filamentosus后，红枣植株内的POD和SOD活性均较对照增加，且MDA含量较对照显著下降（P＜0.05）。以上生理指标充分表明，在干旱胁迫条件下，P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌剂均能通过提高抗氧化酶（SOD和POD）活性来减少植株体内活性氧自由基的积累，从而提高枣树抗旱性，缓解干旱胁迫的危害。除此之外，脯氨酸（Pro）的积累有助于维持植物细胞的渗透调节，在缺水条件下保护大分子和细胞膜组织[33]。本研究接种P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌剂均能诱导脯氨酸在红枣叶片中的积累，这表明菌株P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌剂在干旱胁迫下能稳定植株渗透压力，提高植株耐旱性。

IAA作为促进植物生长的一种重要激素，在干旱胁迫条件下，可以通过调节根系发育和结构，来增加根系对水分和养分的吸收。花东来[34]在干旱胁迫条件下，接种PGPR对番茄生长影响的研究中表明，植物根际促生细菌A25（Sphingo bacterium）可通过增加番茄植株内IAA含量，来增强植株的抗旱性。这些研究表明，在干旱胁迫下，有益微生物能够调节植物体内IAA的产生。本研究结果显示，在不同干旱胁迫条件下，接种P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌剂均能提高红枣叶片的IAA含量，并且植株地下部干质量有显著上升，这说明植物根际促生细菌P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌剂能够通过增加红枣植株体内IAA含量，促进根系生长，增加根系对水分和养分的吸收，从而提高枣树的抗旱性。此外，ABA作为植物体内积累的一种重要胁迫激素，在水分亏缺时通过控制气孔关闭和胁迫信号转导通路，来调控水分损失。水分胁迫程度越严重，植株体内ABA含量越高。本研究结果表明，在不同干旱胁迫程度下，接种P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌剂均可有效降低ABA含量，这也间接地反映了在胁迫条件下，接种PGPR可以减缓植株受胁迫的程度。同时，干旱胁迫下接种各菌剂后，红枣植株的气孔导度、净光合速率、胞间CO2浓度、叶绿素含量升高，地上部干重增加，说明在干旱条件下菌株P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌剂均能通过降低ABA含量，打开气孔，增强光合作用，从而促进红枣植株生长。

众所周知，各菌群之间存在相互作用，它们在发挥作用的过程中不是独立的。余旋等[35]在不同解磷菌剂对美国山核桃（Carya illinoinensis）根际微生物和酶活性影响的研究中发现，绿针假单胞菌、荧光假单胞菌和蜡样芽孢杆菌这3种混合菌剂的效应优于单一菌剂。艾星梅等[36]在弱光下接种PGPR对重瓣百合（Lilium browniivar.viridulum）开花期光合特性及生长影响的研究表明，鞘氨醇杆菌属、不动杆菌属和黄金杆菌属3种细菌的混合菌液接种效果最佳。本研究中，在不同干旱胁迫程度下，P. koreensis和B. filamentosus的混合菌剂接种效应均优于任何一种单菌剂。其原因可能是这2株菌株在混合后能够发挥正向协同作用。一方面，可以合成或分泌一些不同于单菌株的生理活性物质[37]，来影响植物的生理代谢，进而促进植物的生长；另一方面，混合菌剂能够增强它们在胁迫条件下的定殖能力。土壤中的菌株数量越多，分泌的生长激素、ACC脱氨酶、胞外多糖等生理活性物质越多，从而提高菌剂对土壤中营养物质的活化能力，促进红枣植株对土壤水分、养分的吸收，缓解干旱胁迫对红枣植株的伤害。因此，P. koreensis和B. filamentosus混合菌剂可能更有利于生物肥料的开发与应用。但对这2株菌株在混合后发挥正向协同作用的机理有必要进行深入研究。