首次建立灰霉菌基因组的无标记编辑的CRISPR/Cas体系（2020.8.20 植物微生物最前线）

灰霉病菌（Botrytis Cinerea）是一种植物致病性子囊菌，侵染上千种植物，引起灰霉病，每年给水果、蔬菜和花卉造成超过10亿美元的损失。由于其在世界范围内的发生、巨大的经济意义和非特异性的坏死性生活方式，它已被列为第二大植物病原真菌（点击查看：十大植物病原真菌）。灰霉病的控制通常需要反复使用杀菌剂，特别是在高湿度条件下，但快速的适应和抗药性发展已经大大降低了世界范围内许多大田和温室作物的药效。自从琥珀酸脱氢酶抑制剂杀菌剂（SDHI）以来，在过去的几年里，没有新的主要抗真菌作用模式来控制灰霉病。目前，灰霉病菌的基因组序列已经发表，为灰霉病菌的遗传操作提供了序列基础。

2020年8月17日，国际著名期刊PLOS？Pathogens在线发表了来自德国凯泽斯劳滕大学生物系Matthias Hahn课题组题为：“CRISPR/Cas with ribonucleoprotein complexes and transiently selected telomere vectors allows highly efficient marker-free and multiple genome editing in Botrytis cinerea”的研究论文，首次建立了灰霉菌基因组的无标记编辑的CRISPR/Cas体系！

目前，CRISPR/Cas已经成为在不同生物体中进行基因操作的最先进技术，使得基因精准改变能够以前所未有的效率进行。CRISPR/Cas核糖核蛋白（CRISPR/Cas ribonucleoprotein，CRISPR/Cas RNP）复合体介导的基因组编辑技术是当前最重要的无外源DNA整合在基因组上的编辑技术之一。该技术摒弃了编码Cas蛋白和向导RNA的DNA载体，在试管中将纯化的Cas蛋白和向导RNA（gRNA）预先组装成具备完整活性的CRISPR/Cas RNP复合体，再将CRISPR/Cas RNP通过物理或者化学的方法直接导入细胞，从源头上避免了在受体基因组中插入外源DNA。同时，因为导入的是具有完整活性的CRISPR/Cas RNP复合体，CRISPR/Cas RNP进入细胞后可以立即发挥功能，迅速切割靶位点的基因组DNA;又由于Cas蛋白和向导RNA的半衰期均较短，细胞中又没有新的Cas蛋白和向导RNA持续合成，所以CRISPR/Cas RNP对基因组DNA的切割被限定在一个短暂的时间内，得到的编辑产物在嵌合率和脱靶率方面均优于使用编码Cas蛋白和向导RNA的DNA载体得到的编辑产物。

本研究首次建立了灰霉菌基因组的无标记编辑的CRISPR/Cas体系，每次转化产生多达数千个编辑的转化子。首先，通过利用SV40（4x）和Stua（2x）NLS序列的C末端串联阵列实现了有效的Cas9核靶向，同时将有效的Cas9核靶向组成核糖核蛋白复合物（RNP），提高了CRISPR系统的高效递送;其次，利用带有端粒的质粒实现无选择标记的筛选体系。其原理是，含有一对端粒的质粒（Ptel）不仅可以有效地转化到丝状真菌中，并以着丝粒微染色体的形式在那里自主复制，并且在没有选择压力的情况下很快就会丢失。作者将RNP和修复模板与不稳定的端粒载体相結合，导入真菌原生质体中进行基因编辑。研究证明，与现有的基于CRISPR/Cas的方法相比，这种方法在丝状真菌（包括模式植物病原菌稻瘟菌）中提供了更好的基因编辑效率，并导致非常低数量的额外非靶标突变。其有效性取决于：

1）提供选择的端粒载体的高转化效率;

2）质粒载体和CRISPR组件的高共转化/编辑率;

3）产生高效的HR和/或NHEJ;

4）在鉴定所需的编辑事件之后消除端粒载体，产生没有任何其他基因组改变的编辑菌株。用这种方法，重复获得了成百上千个转化子，其中高达65%的转化子是无标记编辑的。

同时更重要的是，作者也证明该系统的编辑对另一种丝状真菌稻瘟菌也起到了很好的作用，这表明它可以应用于许多真菌。该转化体系有望加速灰霉菌和其他真菌的分子研究。