甘油二酯的合成及纯化研究进展

高正松，王保成，徐松泉，李 欢

(南京威尔药业集团股份有限公司，江苏 南京 210042)

甘油二酯，亦称甘二酯或二脂肪酸甘油酯，可由甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)中一个脂肪酸醇解为羟基所得，也可由两分子脂肪酸与丙三醇(甘油)酯化后得到，英文名称为diacylglycrol或diglyceride，简写为DAG或DG。按照酰基供体脂肪酸与甘油羟基的结合位置不同，甘油二酯可以分为两种立体异构体，其分子结构式如图1所示，其中R或R1是饱和或不饱和脂肪酸基。

图1 甘油二酯的两种结构示意图

属于油脂天然成分的甘油二酯，含量通常小于甘油三酯的5%。日本营养学家Yasukawa[1]研究发现，在体内代谢过程中，甘油二酯，特别是1,3-甘油二酯，其代谢特征不同于甘油三酯。1,3-甘油二酯独特的代谢特征，使其在预防肥胖方面有着一定的作用。

图2 甘油三酯体内代谢途径

体内代谢过程中(图2)，甘油三酯主要有两条代谢途径，分别为：(1)甘油三酯经胰脂肪酶催化水解，生成1,3-甘油二酯，1,3-甘油二酯经胰脂肪酶进一步水解，生成1(3)-甘油单酯，1(3)-甘油单酯经过β-氧化生成人体所需的能量；(2)甘油三酯经胰脂肪酶催化水解生成1,2(2,3)-甘油二酯，1,2(2,3)-甘油二酯可经胰脂肪酶水解生成2-甘油单酯，也可以与体内的游离脂肪酸在酰基转移酶的催化下，重新生成甘油三酯。2-甘油单酯会重新和游离脂肪酸被酰基转移酶酯化为1,2(2,3)-甘油二酯，进而被继续酯化为甘油三酯。当甘油三酯没有被及时消耗转化为能量，便会积蓄在人体内，对人体健康造成危害[2-4]。1,3-甘油二酯的消化途径则防止体内脂肪累积[5-7]。因此食用含有1,3-甘油二酯的油脂具有降低脂肪积累、防止体重增加的效果。

1,3-甘油二酯不同于甘油三酯的独特代谢方式，使得其具有重要的潜在价值。1,3-甘油二酯不仅可以作为保健油脂，还可以作为医药辅料、化妆品辅料、药物合成中间体等，市场广阔，经济价值可观。1,2-甘油二酯作为1,3-甘油二酯的同分异构体，虽然代谢方式有别于1,3-甘油二酯，但是其作为食用油脂的重要成分，同样被广泛地应用于食品行业中。

天然存在的甘油二酯很少，主要是通过油脂的产后修饰技术获得。就方式而言，产后修饰可以由生物催化剂实现，也可由传统的化学催化剂完成。产后修饰技术所得的甘油二酯，在纯度和选择性上很难满足现阶段医药辅料、化妆品辅料和药物合成中间体的需求，故研究者们将目光投向了合成法制备甘油二酯的领域。本文从不同的合成路线出发，介绍了几种1,3-甘油二酯和1,2(2,3)-甘油二酯的合成方法，并对其后续的纯化方法进行了简要阐述。

1 1,3-甘油二酯的合成

从制备机理看，1,3-甘油二酯的制备方法主要分为酶法与化学合成法两种[8-11]。酶合成法的优势在于环境友好、无污染、耗能小；化学合成法的优势在于利用特定的合成底物与催化剂，可定点催化合成高纯度的1,3-甘油二酯。

1.1 酶法制备1,3-甘油二酯

酶法合成1,3-甘油二酯的方法主要包括甘油解法、酯交换法、直接酯化法[12]。

1.1.1 甘油解法制备1,3-甘油二酯

酶催化甘油解法是以甘油三酯和甘油为原料，在1,3-特异性脂肪酶的催化下制备1,3-甘油二酯的反应(图3)。Gotog等[13]以特异性脂肪酶Lipase 3A为催化剂，以菜籽油、大豆油和甘油为原料，成功制备了含量在40%以上的1,3-甘油二酯。Kahveci等[14]以甘油和菜籽油为原料，诺维信435为催化剂，制备了含量在40%～50%的1,3-甘油二酯。Valerio等[15]以同样的酶为催化剂，以甘油和橄榄油为原料，在乳化体系下，最终得到了含量仅为17%的1,3-甘油二酯。Yamane等[16]以氢化牛油和甘油为原料，通过不断析出固体的方法，在78 h后得到了含量为90%的1,3-甘油二酯产物。Liao等[17]将甘油和三油酸甘油酯以1：2的摩尔比混合，加入一定量溶剂后，在Lipozyme IM-77的催化作用下，反应24 h后，制备得到了含量最大值为40%的1,3-甘油二酯。

甘油解法虽然工艺简单，但耗时长，产物纯度低，而且产品得率低，因此不适合用于生产1,3-甘油二酯。

图3 甘油解法制备1,3-甘油二酯

1.1.2 酯交换法制备1,3-甘油二酯

酶催化酯交换法制备1,3-甘油二酯以甘油三酯和甘油单酯(或脂肪酸甲酯)为原料，在特异性脂肪酶的催化下，生成1,3-甘油二酯(图4)。Weber等[18]以菜籽油和甘油单酯为原料，以脂肪酶Lipozyme RM IM为催化剂，成功制备了含量为75%的1,3-甘油二酯。杜伟等[19]在叔丁醇溶液中，以特异性酶催化了甘油单酯的酯交换反应，通过对反应温度和反应时间的探究，得到了含量大于75%的1,3-甘油二酯产物。李磊等[20]以旋转蒸发仪为反应容器，以脂肪酶Lipozyme RM IM为催化剂，催化了米糠油和甘油单酯的酯交换反应，最终得到了含量为27%的1,3-甘油二酯。Blasi等[21]以Novozyme 435为酯交换催化剂，通过一锅两步法制备了最终含量为60%的1,3-甘油二酯。

图4 酯交换法制备1,3-甘油二酯

酯交换法制备1,3-甘油二酯的本质为两步反应的复合反应，第一步是甘油三酯的水解反应，第二步是水解后的酯化反应。在酯交换法制备1,3-甘油二酯的过程中，如何实现复合反应中水解和酯化的平衡是难点，且酶催化酯交换法制备1,3-甘油二酯的原料成本较高，故不宜工业化生产。

1.1.3 酯化法制备1,3-甘油二酯

酶催化酯化法制备1,3-甘油二酯是以甘油和脂肪酸为原料，以特异性脂肪酶为催化剂，制备1,3-甘油二酯，在酯化过程中，会生成相应的副产物甘油三酯、1,2-甘油二酯和甘油单酯等(图5)。Rosu等[22]以甘油和乙酸为原料，以固定化脂肪酶为催化剂，在没有溶剂的条件下，制备了1,3-二乙酸甘油酯。在反应8 h以后，甘油二酯的含量可达84%。李湘等[23]以诺维信435为催化剂，调整油酸和甘油的比例为2.27：1，在真空除水的条件下反应6 h，可以得到含量为70%的甘油二酯产物。Wang等[24]以磷脂酶A1为催化剂催化制备了1,3-甘油二酯的合成，在反应4 h后，可获得最终含量为43%的甘油二酯产物。Liu等[25]用同样的磷脂酶A1为催化剂，催化了油酸和甘油的酯化反应，通过调整油酸与甘油的比例为1：5，在4%催化剂含量下，40 ℃反应1.5 h，可得纯度为54%的1,3-甘油二酯。Duan等[26]和Watanabe等[27]利用特异性脂肪酶，均成功催化了1,3-甘油二酯的合成，Watanabe在真空条件下除去生成的水，反应3 h后即得到了含量为70%的1,3-甘油二酯产物。

图5 酯化法制备1,3-甘油二酯

Fig.5 Preparation of 1,3-diacylglycrol by esterification

直接酯化法具有反应时间短、产物纯度高、反应步骤简单等优势，对于制备高纯度的1,3-甘油二酯具有重要的意义。

1.2 化学合成法制备1,3-甘油二酯

化合合成法制备1,3-甘油二酯的优势在于，当反应底物特定，在特定的催化剂催化下，可以高效制备高纯度的1,3-甘油二酯。

2001年，Imanishi等[28]从1,3-二羟基丙酮出发，与脂肪酸在碱催化下合成1,3-二甘油酯丙酮，再通过硼氢化钠对2位羰基进行还原，最终得到1,3-甘油二酯(图6)。

图6 1,3-二羟基丙酮与脂肪酸反应制备1,3-甘油二酯

2011年，Harbige等[29]同样从1,3-二羟基丙酮出发，合成了用于治疗神经疾病药物的重要中间体1,3-甘油二酯。

2014年，Sonoke等[30]以1,3-二羟基丙酮二聚体为原料，通过与醇缩合制得1,3-二甘油酯丙酮，再利用还原试剂将1,3-二甘油酯丙酮还原为1,3-甘油二酯(图7)。这种先缩合再还原的方法可以高效制备1,3-甘油二酯。

图7 1,3-二羟基丙酮二聚体为原料制备1,3-甘油二酯

2014年，Narine等[31]从丙酮缩甘油出发，与酰氯反应首先制备两端羟基被保护的甘油单酯，甘油单酯在酸性条件下脱保护，脱保护后的甘油单酯与另一摩尔当量的酰氯反应，制备1,3-甘油二酯(图8)。该方法的优势在于可以制备1,3位不对称的甘油二酯。当R1与R2相同时，又可以制备高纯度的对称的1,3-甘油二酯。

图8 丙酮缩甘油为原料制备1,3-甘油二酯

2 1,2-甘油二酯的合成

1,2-甘油二酯多以化学合成法制备，利用特定的底物和催化剂，可以高效制备高纯度的1,2-甘油二酯。

1991年，Charles Mioskowski等[32]以丙酮缩甘油为原料，先利用3,4-二甲氧基苄基氯对羟基进行保护，之后在酸性条件下将丙酮保护的羟基进行脱保护，使1,2号位的羟基裸露。将3号位羟基被保护的甘油与脂肪酰氯反应，制备3号位羟基保护的1,2-甘油二酯。再对3号位羟基进行脱保护，得到目标产物1,2-甘油二酯(图9)。制备后的高纯1,2-甘油二酯被成功地用于新型脂质体的制备。

图9 丙酮缩甘油为原料制备1,2-甘油二酯

2007年，Richard等[33]从缩水甘油出发，利用叔丁基二甲基氯硅烷对缩水甘油的羟基进行保护，羟基保护后的缩水甘油在雅格博森催化剂的催化下与手性醋酸钴反应，得到手性的羟基被保护的甘油，被保护的甘油在DMAP催化下与油酸反应，得到1,2号位的油酸酯产物，最后将保护羟基的叔丁基二甲基硅烷脱去，得到手性的1,2-二油酸甘油酯(图10)。该法的优势在于可以得到手性的1,2-二油酸甘油酯，但是雅格博森催化剂难以买到，同时在缩水甘油开环的过程中产率较低，不适宜放大生产。

图10 缩水甘油为原料制备1,2-甘油二酯

2016年，肖勇翔等[34]在发明专利《1,2-二酰甘油及其中间体的制备方法》中介绍到，先将丙酮缩甘油的羟基利用氯甲酸-9-芴基甲酯进行保护，再在酸性条件下对保护后的丙酮缩甘油中丙酮保护的两个羟基进行脱保护，脱保护后的产物与脂肪酸进行酯化，最后对酯化产物进行脱保护即可得到1,2-甘油二酯。

图11 以氯甲酸-9-芴基甲酯保护丙酮缩甘油制备1,2-甘油二酯

2017年，韩丽娟等[35]以3-氯甘油为原料，与醋酸钠反应生成3-醋酸甘油单酯，将3-醋酸甘油单酯在碱性催化剂催化下与脂肪酸进行反应，制备1,2-二脂肪酰-3-醋酸甘油酯，最后将上述甘油三酯在甲醇溶液中与碳酸钾进行反应，得到1,2-甘油二酯。该法制备1,2-甘油二酯的优势在于反应步骤相对较短，利于放大生产。

图11 3-氯甘油为原料制备1,2-甘油二酯

3 甘油二酯的纯化方法

1,3-甘油二酯的制备过程中，会产生1,2-甘油二酯、甘油三酯、甘油单酯等副产物；在利用化学法制备1,2-甘油二酯的过程中，同样会因为反应的不完全而生产甘油单酯等副产物，所以需对制备后得到的产物进行纯化分离，才可以得到高纯度的甘油二酯。目前纯化甘油酯的方法主要有以下四种：超临界CO2萃取法、溶剂结晶分离法、分子蒸馏法和柱层析法[36]。

3.1 超临界CO2萃取法

超临界流体兼具气、液、固三相的特性，不仅有着气体的流动性优势，又兼具液体的溶解能力和低粘度特性，因此，超临界流体可以作为优异的萃取溶剂使用。CO2在超临界状态，可以依据待分离物质的沸点高低、极性大小、溶解性的不同、对于热敏感性的差异，达到高效分离物质的目的。在甘油二酯的制备过程中，可以依据超临界CO2独特的萃取性能，将甘油二酯目标产物与甘油单酯、甘油三酯等杂质分离萃取出来，达到纯化甘油二酯的目的。虽然超临界CO2萃取法对于环境无污染、萃取效率高，但是使CO2处于超临界状态并用于萃取的成本太高，不适用于工业化放大生产。

3.2 重结晶分离法

重结晶分离法是依据待分离物质在重结晶溶剂中的溶解度差异，从而实现依次从重结晶溶解中结晶析出达到分离的目的[37]。在甘油二酯的制备过程中，目标产物甘油二酯与杂质在特定溶剂中的溶解度不同，依旧这一特性，选择合适的重结晶溶剂进行重结晶，达到分离纯化甘油二酯的目的。重结晶方法虽然简单，但选择合适的重结晶溶解是个较大的难点。

3.3 分子蒸馏法

分子蒸馏是一种特殊的液-液分离技术。分子蒸馏技术依靠不同物质在高真空下平均自由程的差别来进行分离[38-40]。近年来，重结晶、柱层析等传统分离技术所使用的大量溶剂，给分离物质、环境带来了污染，因此环境友好型的分子蒸馏工艺越来越受到科研工作者和医药化工企业的关注，在油脂产业领域，分子蒸馏技术也得到了广泛的应用[41-42]。邹冬芽等[43]将分子蒸馏技术引入甘油二酯的分离纯化中，得到了最终收率为77%的高纯度甘油二酯。朱思启等[44]在甘油单酯的分子蒸馏纯化工艺中，通过改变蒸馏温度、真空度、刮板转速、进料速率等因素，得到了最终含量为93%的最佳分子蒸馏工艺。王卫飞等[45]在甘油二酯的分子蒸馏纯化工艺中，通过对真空度、蒸馏温度等条件的探索，得到了最优的分子蒸馏工艺，在最佳工艺条件下，可以得到纯度为98%的终产物。

分子蒸馏法具有受热时间短、耗能低、产品色泽好、纯度高等优点，在1,3-甘油二酯的纯化中可以用此方法分离反应中产生的相应副产物。

3.4 柱层析法

柱层析法，又称为色谱柱法，是根据待分离物质在固定相上的吸附能力不同而分离的方法。柱层析法需要选择合适的固定相和流动相，利用流动相的洗脱，实现待分离物质在固定相上的吸附→解吸→再吸附→再解吸过程，从而达到分离纯化目的[46]。Maekawa等[47]将离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为洗脱剂对甘油单酯进行洗脱分离，得到了最终纯度为95%的甘油单酯产品。Zinnen等[48]用柱层析分离技术，实现了甘油单酯、甘油双酯、甘油三酯的高效分离。

4 结 语

合成法制备甘油二酯的发展，弥补了天然甘油二酯在食品、医药等行业的空缺。本文总结了1,3-甘油二酯的酶合成法、化学合成法以及1,2(2,3)-甘油二酯的化学合成法，并归纳了甘油二酯的纯化手段，为后续甘油二酯的合成及纯化提供了参考。