养分增加对蓝莓根部真菌群落的影响

何逸菲 唐卓菲 黄昕怡 颜 劲 吴朱杰KABORE Marthur Fabrice 孙立夫 张艳华

(绍兴文理学院 生命科学学院，浙江 绍兴 312000)

高等植物与土壤真菌常形成互利共生的菌根[1]，杜鹃花科(Ericaceae)植物具有特殊的杜鹃花类菌根(欧石楠类菌根ericoid mycorrhiza，ERM)，在土壤矿化率低、营养贫瘠的恶劣生境条件下能促进宿主对营养元素，尤其是氮(N)和磷(P)的吸收[2-3].然而，随着工农业的高速发展，全球的N沉降逐渐增多[4]，N沉降的加剧使得生态系统的物质循环发生了极大的改变.杜鹃花科植物在N丰富的条件下生长缓慢，甚至不生长[5-6]，高水平的N沉降使荷兰和部分英国欧石楠荒地的优势种由原来的杜鹃花科植物向草本植物方向演替[7]，但是P缺乏减缓了演替过程[8].植物凋落物是森林土壤有机质和养分的主要来源，也是植物与土壤间C、N循环的重要途径[9]，决定着土壤有机N库的大小[10].营养元素特别是P的有效性对调节植物凋落物分解速率和生态系统平衡具有重要作用[11].在陆地生态系统中，N、P和凋落物的输入不仅能导致地上植物群落发生演替，也是地下根部真菌群落演替的驱动力.

杜鹃花科植物长期适应贫瘠的生长环境，养分增加对其根部真菌侵染和ERM真菌群落是否产生影响还知之甚少.本文以盆栽杜鹃花科的蓝莓为研究对象，通过设置不同N、P和凋落物浓度梯度，经过培养，收集不同处理下蓝莓的毛根，比较其根部真菌群落的组成和结构.并通过生态化学计量学特征的研究，建立蓝莓菌根真菌多样性与土壤营养元素之间的关系，探索N、P和凋落物对蓝莓根部真菌群落的影响，以期为养分增加对蓝莓等杜鹃花科植物及其根部真菌群落动态影响的研究提供一定的理论依据.

1 研究方法

1.1 样品培养与采集

在绍兴文理学院的温室中培养具有代表性的ERM植物——越橘属(Vaccinium)的蓝莓(组培的3年生苗木)，通过施加不同浓度梯度的N、P养分、不同质量的杜鹃花植物的叶片凋落物(NH4Cl-N分别为10、50和120 kg N/hm2·a，NaH2PO4-P分别为10、30和50 kg P/hm2·a，以毛杜鹃叶片作为凋落物分别为0.5、1和2 kg/m2·a)，以及中倍量的N与L、N与P混合处理，4个月后各选取3个样株，共采集蓝莓毛根样品和土壤样品各36个.

1.2 样品的处理及分析

1.2.1 蓝莓根部真菌群落的组成和结构

采集蓝莓植株毛根，经过一系列处理后，进行DNA提取，PCR扩增，电泳检测扩增产物，并确定有扩增产物的DNA样品，低温保存，送至生物公司待测，Illumina Miseq PE250/PE300测序：每样品PCR产物大小在300～500 bp，引物为ITS1F-ITS2R.数据抽平后，每个样本均有51 462条reads[12].

1.2.2 元素含量测定

将土壤烘干、研磨、过筛.精确称取样品0.5 g，硝化处理后，在比色管中加双蒸水定容至10 mL，用美国利曼Prodigy XP型电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)测定样品中P、K、Mg、Mn和Cu元素的含量.精确称取样品15 mg，锡箔纸包埋后，用Vario ELⅢ元素分析仪测定C和N的含量，并计算C/N和N/P.

1.2.3 数据处理

数据用Excel 13.0呈现，SPSS 22.0进行方差分析，r软件包进行分析及绘图.

2 结果与讨论

2.1 不同养分处理下土壤中各元素含量的比较

将测量和计算后的部分元素含量和C/N列于表1.

由表1可知，与对照组相比，添加不同浓度N的土壤中Cu含量和C/N都有显著差异(p≤0.05)，P含量有极显著差异(p≤0.01)；添加不同浓度P的土壤中，P和Mn含量都有显著差异(p≤0.05)；添加不同计量凋落物的土壤中，只有K含量有显著差异(p≤0.05)，其余元素含量之间均无显著差异(p>0.05).

添加N、P、凋落物和NP、NL混加的处理组的P、K、Mg、Mn和Cu含量都高于对照组.说明蓝莓生长过程中需要适当添加养分，对土壤中元素含量的保持有利.

2.2 不同养分处理下蓝莓根部真菌群落的组成和结构

将高通量测序检测结果的分类学信息进行综合，与真菌基因库比对后发现，所有处理组的真菌分属于4个门，即Ascomycota、Basidiomycota、Mortierellomycota和unclassified_k_Fungi(未被鉴定的真菌).添加P和凋落物的蓝莓根部真菌群落的组成中目、科、属、种各分类水平的数目均比其他处理组高出2～3倍.由Venn图1可知，CK、P、凋落物和N处理组的蓝莓根部的操作分类单元OTU(Operational Taxonomic Units，相似水平≥97%)分别为59、140、188和81，而共有的OTU为30，其中凋落物和P处理组的特有真菌种类更多，分别为89和46.用Alpha丰度指数和多样性指数进行分析，sobs、chao和ace丰度指数显示，添加的凋落物越高，蓝莓根部真菌群落的丰度越高，而N和P的浓度越高，真菌群落的丰度越低.由shannon和simpson多样性指数可知高N、高L、中P处理组真菌多样性更高.总体而言，凋落物的添加和NP混合添加对蓝莓根部真菌的多样性具有更明显的促进作用.与同属的野生越橘属植物根部真菌相比，盆栽的蓝莓根部真菌物种多样性水平不高,仅有346个OTU，如Vacciniumcarlesii5 595 个OTU[12]和V.mandarinorum1 216个OTU[13].

表1 养分增加后土壤中各元素的变化

以蓝莓根部真菌群落中目水平的物种构建真菌群落结构见图2，仅高L1、高L2、高N3和低P3样本主要是由Sebacinales和GS34组成，其余各组均主要由Archaeorhizomycetales和Sebacinales组成，说明不同养分添加，短期内各处理组的根部真菌群落的结构在目水平上都具有较高的相似性.用主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)，对3个高倍量处理组和对照组的OTU水平进行分析，见图3.主成分PC1和PC2分别为67%和14.69%，高倍量N、P、凋落物和对照组之间的OTU组成和结构差异明显，在第一主成份中高倍量N和凋落物与高倍量P和CK有明显区分，说明添加不同的元素，蓝莓植株的菌根生长过程中共生有不同的真菌；第二主成分中，高倍量N和凋落物之间并未明显划分，说明这两者添加后根部菌根共生的真菌相似性很高.营养元素和凋落物的添加会适当改变蓝莓根部内生菌的组成和结构.这种作用在较短的时间内有显现，长期作用的效果还需进一步观察和检测.

图1 各处理的蓝莓植株根部真菌OTU(CK：对照组；N、L、P：分别添加N、L、P)

图2 各处理组根部真菌群落组成(目水平)

图3 蓝莓根部真菌群落(OTU水平)组成的排序图

2.3 蓝莓根部真菌与土壤因子之间的关系

将各处理的蓝莓根部真菌丰度排前30的OTU与土壤元素含量和元素计量比进行spearman相关性分析，结果见图4.公认的ERM真菌的有4个，其中OTU11为子囊菌的Oidiodendronmaius[14-15]与Mn呈显著正相关，其他3个即OTU22、OTU31和OTU33都是担子菌的Sebacinales真菌目的成员，与多种元素含量呈显著或极显著负相关，Sebacinales的部分成员在全球范围内杜鹃花植物根中普遍存在[16-18].说明土壤中营养元素含量高不利于其ERM功能性真菌的定殖.

将土壤元素和元素计量比与中等水平处理的各组和对照组蓝莓样本及其根部真菌群落(丰度前30的OTU)进行冗余分析RDA(Redundancy analysis)，即环境因子约束化的主成分分析，见图5，中N处理的蓝莓样本和真菌群落都与N/P呈正相关，中N和中NL样本都与K、Mg、Mn和C/N都呈负相关，而中P和中NP的样本和真菌群落都与C、N和N/P呈负相关，从图5可以看出，除P元素外其他的土壤元素含量和元素计量比的影响都比较大.中等水平的凋落物处理组和CK组的各样本和真菌群落没有明显的相关性.进一步说明不加养分或者是仿照自然生态系统仅添加凋落物(缓慢分解释放的养分)可能更加有利于蓝莓根部真菌群落的建立，全球N沉降可能是导致杜鹃花科植物的菌根真菌减少，进而发生地上部分衰退的一个重要原因.

图4 Spearman相关性热图(*0.01

图5 土壤因子、真菌群落和样本之间的关系

3 结论

养分增加对蓝莓根部真菌群落的组成和结构会产生影响，添加凋落物的处理组根部真菌丰度最高，而添加N和P越多，真菌群落的丰度越低；公认的ERM真菌Oidiodendronmaius与Mn呈显著正相关，而Sebacinales与多种元素含量，特别是P呈显著或极显著负相关；RDA分析显示仅添加凋落物或者不添加养分的蓝莓根部真菌群落与土壤主要元素和元素计量比没有相关性.总之，加N和加P不利于蓝莓根部物种丰富度的增加和ERM功能性真菌在群落中的建立.