纤维素酶辅助超声提取节节草中总黄酮的工艺研究

魏建国，孙丽莉，魏涛，刘华敏，潘乐

（1.黄山学院 化学化工学院，安徽 黄山 245041；2.安徽中烟工业有限责任公司技术中心，安徽 合肥 230088）

据《中华本草》记载节节草具有清热、明目、止血、利尿的功效[1]. 现代研究表明节节草含有多种有效组分，如：氨基酸、黄酮、多酚、多糖、总生物碱等[2-4]. 最近，天然产物中黄酮的提取引起人们关注，人们对节节草中的总黄酮的提取展开了一定的研究. 例如，李国庆等[5]采用索氏提取法提取了节节草中的总黄酮，付影超等[6]采用溶剂回流法提取了节节草中的总黄酮. 这些方法可以有效提取节节草中的总黄酮，但是存在着耗时较长的缺点.

超声提取是天然物质活性成分提取的一种有效方法[7-8]. 张俊生等[9]采用超声技术对节节草中的黄酮进行了研究，在耗时较短的情况下有效提取了节节草中的总黄酮，在最佳工艺条件下节节草总黄酮得率为1.16%. 芦宇等[10]在纤维素酶酶解细胞壁的基础上，采用超声技术快速高效提取了红树莓籽中的黄酮类化合物. 然而，迄今为止尚未见到有关纤维素酶辅助超声提取节节草黄酮的报道. 本文研究了纤维素酶辅助超声提取节节草总黄酮的工艺，通过正交设计确定了该法的最佳工艺条件，并对提取物的抗氧化活性进行了检测.

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

仪器：紫外可见分光光度计UV-1100 型，上海美谱达仪器有限公司，K-500DB 型超声清洗仪，合肥金尼克机械制造有限公司.

试剂：芦丁标准品（上海融禾医药科技有限公司，批号140428）、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、水杨酸、维生素C（VC）、维生素E（VE）、过氧化氢，均为分析纯. 2018 年9 月购买节节草于淘宝皇冠店“亳州市九林中药材销售”（经黄山学院生命与环境学院吴永祥副教授鉴定为木贼属节节草Equisetum ramosissimum Desf，样本存放于黄山学院逸夫综合楼5419 实验室）. 购买的节节草经水洗后晾干，然后置于40°C 烘箱干燥三天. 干燥后的样品粉碎，过60 目筛，密封于塑料封口袋中并置于冰箱冷藏室（2 ～8°C ）保存.

1.2 节节草总黄酮的提取

精密称取2.000 g 节节草干燥粉末，用石油醚浸泡过夜，过滤去除石油醚，待残留的石油醚挥发后，将脱脂后的节节草粉末转入250 mL 锥形瓶. 往锥形瓶中加入适量的纤维素酶（20 ～60 mg/g），按预定的液料比（ 20 ： 1～60 ：1 mL/g）、温度（35 ～75°C）、时间（20 ～60 min）用体积分数为60%乙醇作为提取剂进行超声提取. 灭活后过滤并弃去节节草固体残渣，将滤液转移至100 mL 容量瓶，用60%（V/V）乙醇定容. 精密吸收10 mL，置于100 mL 棕色容量瓶中，加水定容，摇匀，即得样品溶液.

1.3 节节草总黄酮的测定方法

精密量取1 mL 样品溶液，加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，充分摇匀后加入1 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀放置6 min 后加入5 mL 10% NaOH 溶液，用60%乙醇定容，摇匀放置15 min 后，在波长510 nm 处测定其吸光度. 用空白试剂作为参比，按照实验测得的标准曲线方程y=0.012 5x+0.0613（R2=0.999 9）计算浓度.

1.4 节节草总黄酮抗氧化性实验

节节草总黄酮抗氧化性实验采用 Fenton 法. 取2 mL 0.020 mg/mL 的节节草总黄酮样品（VC、VE）溶液，加入 3 ×10-3mol/L FeSO4和 2 ×10-3mol/各2 mL，6 ×10-3mmol /L 水杨酸-乙醇溶液3 mL，立即摇匀，加入去离子水定容到25 mL，在37°C下水浴20 min ，用超纯水做空白测量该溶液在510 nm 处的吸光度1A. 用超纯水代替样品溶液，其他操作步骤同上，测溶液在510 nm 处的吸光度记为A0，则：

2 结果与讨论

2.1 纤维素酶用量的影响

2.000 g 节节草粉脱脂后，加入一定量的纤维素酶（40 ～120 mg）和80 mL 60%乙醇，在45°C 下超声提取40 min，结果如图1 所示. 随着纤维素酶用量的增加，节节草总黄酮的得率出现先增加后降低的现象. 当1 g节节草样品中加入纤维素酶用量为50 mg 时出现峰值，节节草总黄酮得率最高，随着纤维素酶用量的进一步增加，总黄酮得率出现下降，这与芦宇等采用超声波-纤维素酶辅助提取红树莓籽黄酮的结果类似[10]，可能是酶解的纤维素吸附在颗粒表面，影响了节节草总黄酮的溶出，因此本实验中纤维素酶的加入量选择为50 mg/g.

2.2 超声时间的影响

2.000 g 节节草粉脱脂后，加入100 mg 的纤维素酶和80 mL 60%乙醇，在45°C 下超声提取一定时间. 超声时间对节节草总黄酮得率的结果如图2 所示. 从图2 可以看出在20 ～50 min，节节草黄酮得率随着超声时间的增加而升高，并在50 min 达到峰值. 之后随着超声时间的增加，节节草总黄酮得率反而下降. 这可能是由于提取时间过长，黄酮类物质被空气中氧气逐渐氧化. 因此节节草总黄酮的最佳超声时间为50 min.

2.3 超声温度的影响

2.000 g 节节草粉脱脂后，加入100 mg 的纤维素酶和80 mL 60%乙醇，在如图3 所示温度（35 ～75°C ）下超声提取40 min. 从图 3 可以看出，温度从35°C 升高到45°C ，酶的活性增强，有利于提取黄酮类物质，提取效果大幅度增加；在45°C 到75°C 之间，得率基本维持不变. 这可能是高温一方面促进了分子的热运动，导致节节草总黄酮快速溶出，另一方面高温会破坏纤维素酶的活性，不利于黄酮的提取，因此45°C 到75°C 的节节草得率恰巧基本不变. 从节省能源角度考虑，提取温度选择为45°C .

图1 酶用量对节节草总黄酮得率的影响

图2 时间对节节草总黄酮得率的影响

图3 温度对节节草总黄酮得率的影响

2.4 液料比的影响

2.000 g 节节草粉脱脂后，加入100 mg 的纤维素酶和一定体积的 60%乙醇，在45°C下超声提取40 min ，液料比对节节草总黄酮提取影响如图4 所示. 在液料比为20 ： 1～40 ：1mL/g 时，节节草总黄酮的得率随液料比增大快速提升. 这可能是因为增加溶剂的量可以降低样品周围的浓度，使细胞壁内外的浓度差增大，有利于有效成分的溶出. 在液料比达到 ：40 1 mL/g 后，得率趋于稳定. 因此考虑选取 ：40 1 mL/g 的液料比对节节草总黄酮进行提取.

2.5 正交实验结果

确定液料比、纤维素酶用量、提取温度和提取时间这4 个因素的水平如表1 所示. 以节节草总黄酮得率作为指标，采用四因素三水平设计的正交实验结果如表 2所示. 观察表2 可以看出，A 因素的极差最大，因此在纤维素酶辅助超声提取节节草总黄酮的工艺条件中，最主要的影响因素是液料比. 以此类推，通过4 个因素的极差大小可以知道4 个因素地位为A＞C＞D＞B. 比较4 个因素均值，很容易得到节节草总黄酮最佳工艺条件为，也 就 是 液 料 比 为 50 ：1 mL/g ，酶 用 量 为60 mg/g，超声温度为55°C ，超声时间为40 min.

由表2 可知，B 项的极差最小. 在没有空列的正交数据下，可以选取极差最小的B 项作为误差对照项，利用SPSS 软件计算主体间效应的检验如表3 所示，可以看到，选取B 为误差对照项时，A 显著（Sig.＜0.05），C、D 项不显著（Sig. ＞0.05）.

图4 液料比对节节草总黄酮得率的影响

表1 正交试验因素表

表2 正交试验设计与结果

表3 主体间效应的检验

2.6 最佳工艺验证

在液料比为 50 ：1 mL/g，酶用量为60 mg/g，超声温度为55°C，超声时间为40 min 的条件下，3次实验提取节节草总黄酮得率的平均值为1.72%.

2.7 节节草总黄酮抗氧化性的研究

Fenton 反应法会产生 ·OH，·OH氧化水杨酸产生有色物质，该物质在510 nm 处有特征吸收峰，若加入清除剂，会抑制有色物质的产生，此时吸收峰会强度减小. 通过测量吸光度A可以计算出节节草总黄酮对·OH的清除作用，从而表征其抗氧化性. 我们对浓度为0.020 mg/mL 的样品进行了测试. 从图5 的结果可以看出，0.02 mg/mL 的节节草总黄酮的·OH清除率达到了61.57%，高于0.02 mg/mL 的维生素E（43.65%），但比同浓度的维生素C（87.12%）要低. 因此，纤维素辅助超声提取的节节草总黄酮具有一定的抗氧化能力.

图5 不同样品的 ·OH清除率(n=3)

3 结论

综上，用正交优化法研究纤维素酶辅助超声提取节节草中总黄酮的最佳提取工艺条件液料比为50 ：1 mL/g，酶用量为60 mg/g，超声温度为55°C，超声时间为40 min，在该条件下提取总黄酮的量为1.72%. 同时研究表明纤维素酶辅助超声提取的节节草总黄酮具有高于同浓度维生素E 的抗氧化能力.