红芪多糖1联合吉非替尼对肺癌A549细胞凋亡的作用及机制探讨

闫立萍 刘华 王小军 罗天雯

甘肃省人民医院呼吸与危重症医学科,兰州730000通信作者：刘华,Email:13919965016@163.com

分子靶向治疗是目前临床针对晚期非小细胞肺癌尤其是存在基因突变的肺腺癌的最新治疗手段。2018年我国最新版肺癌治疗指南中将酪氨酸激酶抑制剂 (tyrosine kinase inhibitors,TKI)药物单用或联合含铂药物化疗作为有EGFR 基因突变腺癌患者(Ⅱ、Ⅲ期)的一线治疗方案。在众多TKI药物中,吉非替尼是上市最早、疗效肯定、经典型TKI药物代表。然而,早期出现耐药是TKI药物临床治疗的硬伤。由此,提高TKI药物敏感性、降低耐药性是目前联合用药,尤其联合中药制剂治疗的探索方向。红芪多糖 (hedysarum polysaccharides,HPS)是甘肃省道地药材,在前期研究中,显示HPS具有显著抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和凋亡的作用[1-3]。HPS由3种单糖组成,其发挥主要作用的组份为HPS1。本研究旨在探讨HPS1 联合吉非替尼诱导肺癌细胞凋亡,以及调节Bax和Bcl-2蛋白表达的机制,以期为中药联合抗肿瘤研究提供新的思路和数据支持。

1 材料与方法

1.1 细胞株及药物 人肺腺癌A549细胞株购自武汉大学保藏中心。HPS1由兰州大学药学院提取并鉴定,为白色絮状粉末,蛋白含量为0.2%,相对分子质量为9.4×104,为均一多糖。吉非替尼购自 英 国 阿 斯 利 康 公 司,DMSO 溶 解 至500 mmol/L,置-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 试剂 DMEM (美国Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),胰酶(美国Difco公司),TRIzol提取试剂盒、反转录试剂盒和实时荧光定量PCR 试剂盒 (日本Ta KaRa公司),MTT (美国Amresco公司),Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒 (美国Beckman Coulter公司),实时荧光定量PCR 引物[宝生物工程 (大连)有限公司]。

1.3 仪器 CO2孵育箱 (美国Thermo 公司,HERAcell150),ESCO 超净工作台 (中国苏州合飞净化设备有限公司,sw-cj-2f),光学倒置显微镜(日本OLYMPUS公司,CKX41+DP21),酶标仪(美国Bio-rad 公司,iMark),流式细胞仪 (美国Becton, Dickinson and Company 公 司,FACSVerse),低温离心机(德国Eppendorf公司,Centrifuge 5427R)。

1.4 细胞培养方法 A549细胞株用含10%胎牛血清的DMEM 液培养,在37℃、5%CO2的恒温箱中培养,隔天观察细胞贴壁情况并换液。贴壁生长良好的A549细胞经0.25%胰蛋白酶消化,选用对数生长期细胞进行实验。

1.5 MTT 检测方法 将细胞悬液移入3块96孔板,接种细胞密度为1×104个细胞/孔,培养24 h后,各实验组按终浓度配置并加入96孔板,每个浓度设5 个平行孔。共设3 个时间点 (6、24、48 h),每个时间点取一块96 孔板,每孔加入MTT 溶液(5 g/L)20μl,继续培养4 h后小心吸弃所有溶液,加入SDS细胞裂解液100μl,4℃反应过夜,取出后置水平摇床10 min充分溶解。最后用酶标仪于490 nm 波长处测定各实验组 [50、100、200、400 mg/L HPS1 组；2.5、5、10、15 mg/L 吉 非 替 尼 组；HPS1 (50、100、200、400 mg/L)联合吉非替尼5 mg/L 组]吸光度值。细胞活力用实验组吸光度值占对照组 (完全培养液)吸光度值的百分比表示。

1.6 流式细胞术检测 将细胞以1×106个/瓶的密度接种于培养瓶中,观察细胞贴壁后换液,实验分组：对照组(完全培养液)、HPS1组(200 mg/L)、吉非替尼组(5 mg/L)、HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L组。作用24 h后消化细胞,1 500 r/min离心5 min,离心半径29.9 cm,弃去上清液,PBS冲洗2次。再次1 500 r/min离心5 min,离心半径29.9 cm 后收集细胞,缓缓加入适量-20 ℃预冷的70%乙醇溶液,1 500 r/min 离心5 min,离心半径29.9 cm,PBS 洗涤2 次,收集细胞,加入10μl AnnexinⅤ-FITC 避光染色30 min,最后上流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期分布情况。细胞凋亡率 (%)=凋亡细胞计数/所有细胞计数×100%。

1.7 实时荧光定量PCR 法 细胞接种于培养瓶并融合至单层后,倾去原培养液,加入含各实验浓度的完全培养液,实验分组：对照组(完全培养液)、HPS1 200 mg/L组、吉非替尼5 mg/L 组、HPS1 50 mg/L+吉非替尼5 mg/L组、HPS1 100 mg/L+吉非替尼5 mg/L组、HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L组。继续培养24 h后,弃去上清液,PBS冲洗2次,TRIzol法提取总RNA,分光光度法测定其纯度及浓度。反转录试剂盒反转录各组细胞总RNA,生成cDNA,进一步用目的基因引物及内参β-actin行引物扩增 (表1)。PCR 结果由Rotor-Gene 6软件分析,确定各反应样本的Ct值,采用相对定量的2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量,分析各样本之间目的基因的表达差异。

表1 RT-PCR 所用引物及相关参数

1.8 统计学分析 采用SPSS 22.0统计学分析软件处理各实验数据。每个实验组均设5个平行孔,数据用x-±s表示。组间比较采用单因素方差分析及t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT 实验结果 MTT 法检测结果显示,HPS1各浓度组从6 h开始细胞活力下降,并持续到48 h。与对照组比较,HPS1各浓度组24、48 h细胞活力明显降低,差异均有统计学意义 (P值均＜0.05),半数抑制浓度为205.5 mg/L。200 mg/L HPS1组与400 mg/LHPS1组在各时间段细胞活力比较差异均无统计学意义 (P＞0.05)。吉非替尼各浓度组在不同时间点 (6、24、48 h)对A549细胞均有抑制作用,其抑制作用呈现浓度、时间依赖性,半数抑制浓度为4.8 mg/L(图1)。

HPS1 (50、100、200、400 mg/L)联合吉非替尼(5 mg/L)组在不同时间段 (6、24和48 h)的细胞活力均较吉非替尼单独处理 (5 mg/L)细胞活力降低,差异均有统计学意义 (P值均＜0.05),见图1。

图1 MTT 法检测HPS1联合吉非替尼对A549细胞增殖的抑制作用

2.2 流式细胞术检测结果 各组细胞作用24 h后,HPS1 200 mg/L组及吉非替尼5 mg/L组细胞凋亡率均较对照组高[(3.13±0.20)%、 (14.65±0.41)%、 (0.03±0.01)%,P值均＜0.05),且HPS1 200 mg/L组及吉非替尼5 mg/L 组的G1+S 期细胞比例均较对照组升高 (97.22%、100.00%、91.07%,P值均＜0.05),而HPS1 200 mg/L组及吉非替尼5 mg/L组G2期细胞比例较对照组明显降低 (2.78%、0.00%、8.94%,P值均＜0.05)；HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L组细胞凋亡率较吉非替尼5 mg/L组高,差异有统计学意义[(28.72±1.08)%比(14.65±0.41)%,t=2.412,P＜0.05],2组G1+S期细胞比例均为100%。见图2。

图2 流式细胞术检测HPS1联合吉非替尼对A549细胞周期分布和凋亡的影响 A：对照组；B：HPS1 200 mg/L组；C：吉非替尼5 mg/L组；D：HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L组

2.3 RT-PCR 检测结果 HPS1各浓度组及吉非替尼组的Bcl-2 mRNA 表达水平较对照组降低,差异均有统计学意义 (P值均＜0.05)；而HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L组的Bcl-2 m RNA 表达较吉非替尼5 mg/L组降低,差异有统计学意义(t=98.56、88.48,P值均＜0.05)。与之相反,HPS1各浓度组及吉非替尼组的Bax m RNA 表达水平较对照组明显升高,差异有统计学意义 (P值均＜0.05)；HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L组Bax m RNA 的表达水平较吉非替尼5 mg/L 组升高,差异有统计学意义(t=37.75、51.02,P＜0.05)。见表2。

表2 RT-PCR 法检测HPS1联合吉非替尼对A549细胞Bax/Bcl-2 mRNA 表达的影响 (±s)

注：HPS1为红芪多糖1；与对照组比较,a P ＜0.05；与吉非替尼5 mg/L组比较,b P ＜0.05

组别 Bax mRNA 相对表达量Bcl-2 mRNA 相对表达量对照组 1.00±0.00 1.00±0.00吉非替尼5 mg/L组 56.80±2.45a 0.21±0.02a HPS1 50 mg/L组 4.82±0.13a 0.78±0.02a HPS1 100 mg/L组 4.08±0.16a 0.53±0.03a HPS1 200 mg/L组 5.58±0.14a 0.31±0.02a HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L组 58.80±3.43b 0.12±0.02b F 值 3.71 18.51 P 值 0.023 0.041

3 讨论

吉非替尼是近十余年来在临床应用较为广泛的TKI药物,已经被列为治疗存在EGFR 基因突变的肺腺癌的一线药物,然而临床工作中对于TKI药物的耐药始终是困扰医师及制约肺腺癌患者治疗的最大因素。探讨抑制或减缓TKI药物耐药的机制是目前抗肿瘤研究领域的热点[4]。在此机制中,中药辅助分子靶向药物及化疗药物增强抗肿瘤作用越来越多的受到关注。本文立足于此,探讨红芪联合分子靶向药物吉非替尼的抗肿瘤作用机制。

中药红芪是甘肃省道地药材。研究发现红芪中提取出的生物活性物质HPS具有抗肿瘤作用[5-8],但其机制目前尚不十分清楚。课题组前期研究发现红芪多糖作用于人肺腺癌A549 细胞,通过HPS诱导肿瘤细胞凋亡以及促使肿瘤细胞中Bcl-2/Bax比例下降,进而抑制其增殖,诱导凋亡[8-9]。在课题组后续研究过程中发现HPS抑制A549细胞增殖、诱导凋亡可能与调控细胞内氧化/抗氧化平衡机制有关[10]。本课题组在既往研究的基础上,讨论HPS1 联合吉非替尼对人肺腺癌A549 细胞活力、凋亡的影响,为中药辅助抗肿瘤治疗及筛选新的抗肿瘤中药提供理论基础和实验数据支持。

细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下,严格通过DNA 复制、RNA 转录和蛋白质合成等复杂反应而进行的分裂系列过程。此前研究结果提示HPS1可抑制A549细胞增殖[10-11],本实验在前期实验基础上更进一步,通过MTT 法检测吉非替尼单独及联合HPS1各浓度组对A549细胞增殖的影响,发现HPS1联合吉非替尼可提高吉非替尼对A549细胞增殖的抑制作用,有协同抗肿瘤作用。

细胞凋亡属于细胞程序性死亡,是一种细胞生理性、主动性的自杀行为。细胞凋亡的信号传递途径及调控机制复杂。目前认为细胞凋亡的发生主要有两条信号传导途径,一条途径为死亡受体通路,另一条途径为线粒体信号通路。它们对细胞的正常代谢、增殖、分化、凋亡的调控具有重要的调控作用。调控异常是肿瘤发生的一个重要原因,因此通过阻滞细胞周期,或影响细胞周期的某一环节,从而诱导肿瘤细胞凋亡,是抗肿瘤药物发挥抗肿瘤作用的重要机制。本研究发现,HPS1和吉非替尼均可使A549细胞凋亡率增加,HPS1联合吉非替尼组细胞凋亡率最高,且使细胞周期阻滞于G1和S期,从而抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡。这提示HPS1可增强吉非替尼诱导的A549细胞凋亡,这与此前相关报道吻合[11]。

Bax基因属Bcl-2基因家族,是极重要的促细胞凋亡基因之一。研究发现,Bcl-2/Bax蛋白的比例大小是决定细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。体外研究发现,高表达的Bcl-2可抑制化疗或放疗诱导肿瘤细胞凋亡,是放化疗失败的主要原因[12]。本研究发现,HPS1联合吉非替尼组Bcl-2/Bax比例下降较单用吉非替尼组更为显著,提示HPS1可增强吉非替尼体外化疗的作用。其途径可能是通过调控Bcl-2与Bax的表达而诱导A549细胞凋亡和分化,抑制肿瘤细胞的增殖。另外有研究报道,HPS1还可以通过调节机体非特异性免疫而增强患者抗肿瘤能力[13]。综上所述,HPS可增强吉非替尼的抗肿瘤作用,发挥协同抗肿瘤作用。其机制可能与调节肿瘤细胞表达Bcl-2/Bax 蛋白的比例有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突