基于细胞骨架重塑促进肠上皮细胞AJC组装探讨揉腹法治疗非酒精性脂肪肝病的作用机制

董桦 张玮 荣兵

(天津中医药大学第一附属医院推拿科，天津 300193)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)具有患病率高、病情复杂、缺乏标志物等特点〔1〕。NAFLD的发病机制较为复杂，主要包括胰岛素抵抗、肝脏脂质代谢紊乱、氧化应激与脂质过氧化等，目前，尚缺少治疗NAFLD的特异性药物〔2〕。药物治疗是当前治疗NAFLD的首选，但研究发现，不论是西药还是中药在治疗NAFLD的过程中均会产生一定的不良反应，因而降低了患者的依从性和疗效。因此，积极探索副作用小且疗效确切的新方法，对NAFLD的治疗具有重要临床价值。揉腹法作为传统中医外治法中的重要一员，可通过刺激腹部胃肠神经，调节胃肠激素分泌和免疫功能发挥治疗疾病的作用，其具有创伤小、易接受且效果确切等优势，已广泛用于慢性浅表性胃炎、小儿积滞、痛经、便秘等疾病的治疗〔3～5〕。张玮等〔6〕通过对61例NAFLD患者分组进行治疗后发现，与西药组相比，揉腹法组患者可显著改善患者血脂和肝功能水平、提高NAFLD的临床疗效，提示揉腹法对NAFLD也具有一定的治疗作用，但其作用机制尚未见报道。顶端连接复合体(AJC)在调节肠上皮细胞的屏障功能中发挥着重要作用，当其结构被破坏时，会引起肠道炎症反应，使肠道屏障通透性增加，导致细菌脂多糖/内毒素(LPS)入血，从而破坏胰岛细胞，诱发机体胰岛素抵抗(IR)，最终造成NAFLD〔7〕。本研究拟在确定揉腹法治疗NAFLD大鼠具有确切疗效的基础上，考察其对大鼠肠黏膜中AJC水平的影响；同时对闭合小环蛋白(ZO)-1，咬合蛋白(Occludin)，上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)，β-连环蛋白(catenin)，闭合蛋白(Claudin)1等AJC通路相关信号分子水平进行检测，以期获得揉腹法治疗NAFLD的部分可能机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1大鼠 选取43只健康SD大鼠，雄性，6～8 w，体重200～250 g，由成都达硕生物科技有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(川)2018-0024，动物使用许可证号：SYXK(川)2018-0057，动物质量合格证号：2018071605，适应性饲养1 w，期间给予自由饮水和饮食，光照白昼各12 h。

1.1.2主要实验试剂 4%多聚甲醛(上海远慕生物科技有限公司，批号：YM-MY803J)；天冬氨酸转移酶(AST)、游离脂肪酸(FFA)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和三酰甘油(TG )、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号分别为：E-EL-R0355c、E-EL-0047c、E-EL-R0013c、E-EL-R0145c)；FITC-Dextran(美国Chondrex公司，批号：4009R)；抗ZO-1(单克隆兔抗)、抗Occludin(单克隆鼠抗)、抗β-catenin(单克隆兔抗)、抗E-cadherin抗体(单克隆兔抗)(美国Cell Signaling Technology公司，批号分别为：43966S、14472S、8480S、13667S)；抗Claudin1(单克隆鼠抗)(美国R&D Systems公司，批号：MAB4219)；免疫组化试剂盒(北京博奥龙免疫技术有限公司，批号：BF06099)。

1.1.3主要仪器和设备 SSW-3型显微外科手术器械包(上海手术器械厂)；纤维素滤膜(0.22 μm)、混合纤维素滤膜(0.45 μm)(德国BM公司)；-80℃超低温冰箱(青岛海尔集团有限公司)；4℃、-20℃冰箱(合肥美菱股份有限公司)；H1650-W离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司)；TGL-20M高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司)；CKX41倒置显微镜、IX-71荧光倒置显微镜(日本Olympus光学工业株式会社)；Infinite M1000 Pro全波长酶标仪(瑞士TECAN公司)；TANKPE060高纯水机(美国Millipore公司)。

1.2实验方法

1.2.1动物分组和模型建立〔8〕43只大鼠，适应性饲养1 w后，称取体重，根据体重分层随机分成：正常对照组(10只，A组)，造模组(33只)。造模组大鼠喂养高脂饲料进行造模；A组大鼠喂养普通饲料，两组均给予自由饮水。喂养10 w后，从造模组随机取3只，验证造模效果，再将造模成功大鼠随机分模型组(B组)、揉腹法组(C组)和药物治疗组(D组)各10只。

1.2.2实验动物治疗 A组和B组均不做任何处理。C组〔4〕：采用的推拿方法是和解肝脾腹部推拿法，操作步骤：(1)将大鼠以仰卧位固定于实验台上；(2)操作者站立于大鼠左侧，微屈右手指关节使其呈拱手状，同步弯曲腕关节，并拢食指和中指，保持好手型扣于大鼠腹部；(3)来回绕动腕关节，由食指桡侧和中指指面向食指指面和中指尺侧方向部揉触腹部，并不停重复；(4)揉动频率：20～30次/min，10 min/(只·d)，共持续28 d。D组灌胃给予多烯磷脂酸胆碱0.12 ml/(100 g·d)〔9〕，6次/w，连续28 d。

1.2.3取材 依照实验设计方案，称重后，采用7%浓度水合氯醛对大鼠进行麻醉，利用股动脉放血处死大鼠，血液静置30 min后，4℃，2 000 r/min，离心半径8 cm，进行离心，取上清液保存备用。快速开腹，分离肝脏，称重，切取肝上叶保存于-80℃冰箱备用，剩余肝组织保存于4%多聚甲醛溶液。分离肠黏膜组织，保存于-80℃冰箱备用。

1.2.4ELISA (1)在微量反应板每孔加入待检标本50 μl，设阳性、阴性对照各2孔，每孔加入阳性(或阴性)对照各1滴，并设空白对照1孔；(2)每孔加入酶结合物1滴(空白对照除外)，充分混匀，封板，置37℃孵育30 min；(3)弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5 s，甩干，重复5次后拍干；(4)每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，封板，置37℃孵育15 min；(5)每孔加终止液1滴，充分混匀；(6)用酶标仪读数，取波长450 nm，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值；(7)实验结果与评价样品OD值≥2.1阴性对照平均OD值，判断为阳性，否则为阴性；阴性对照OD值<0.05作0.05计算，>0.05按实际OD值计算。

1.2.5苏木素-伊红(HE)染色 (1)固定：将取得的大肝组织标本放置在4%浓度的甲醛溶液中充分浸泡30～50 min；(2)脱水：分别用70%、80%、90%、95%、100%酒精进行梯度脱水；(3)透明：用二甲苯将标本透明2次，以替换标本组织内酒精，此过程需不断观察，直至标本透明似琥珀；(4)浸蜡：将透明标本组织放置在溶化好的石蜡里，置于溶蜡箱在65℃下保温2 h；(5)包埋：观察石蜡完全浸入到组织中以后进行包埋，待其冷却凝固以后便成为蜡块；(6)编号：记录为标本来源大鼠编号；(7)切片：标本组织蜡块用切片机在其中部自动横行切取3张4 μm厚的薄片；(8)贴片：将切片在热水中烫平，然后再贴在玻片上，置于烤箱58℃恒温保持4 h；(9)染色：在脱蜡和水洗之后，采用苏木素进行染色，保持3 min，继续水洗之后再蓝化，保持10 min，使用1%浓度的盐酸酒精再进行分化，保持20 s，最后伊红染色，保持5 min；(10)封片：使用70%、80%、90%、95%、100%酒精依次进行脱水，各自保持3 min，使用二甲苯进行透明，保持5 min，最后使用中性树脂胶完成封片。采用CKX41倒置显微镜精细观察肝组织和肠组织病理改变(大鼠回肠组织病理HE染色方法参考肝组织HE染色)。

1.2.6Masson染色法 (1)切片常规脱蜡至水，用配制好的Weigert铁苏木素染色5～10 min；(2)用酸性乙醇分化液分化，水洗；(3)用Masson蓝化液返蓝，水洗；(4)蒸馏水洗1 min；(5)丽春红品红染色液染色5～10 min；(6)在上述操作过程中按蒸馏水:弱酸溶液=2∶1比例配制弱酸工作液，用弱酸工作液洗1 min；(7)磷钼酸溶液洗1～2 min；(8)用配制好的弱酸工作液洗1 min；(9)直接入苯胺蓝染色液中染色1～2 min；(10)用配制好的弱酸工作液洗1 min；(11)95%乙醇快速脱水，无水乙醇脱水3次，每次5～10 s；(12)二甲苯透明3次，每次1～2 min，中性树胶封固。采用CKX41倒置显微镜精细观察并记录。

1.2.7用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran) 示踪法 分离大鼠肠道，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，使用丝线回肠末端进行结扎，然后向肠腔注入FITC-Dextran溶液(使用前利用0.1 mmol/L PBS，配制成20 mg/ml)0.5 ml，再对升结肠末端进行结扎。操作时要注意轻柔，防止肠系膜血管损伤和FITC-Dextran液体泄漏。将包扎好的肠袋放于10 ml生理盐水中，37℃水浴，60 min。采用荧光分光光度计检测荧光值，计算生理盐水中FITC-Dextran含量(含量越高，肠道通透性好)。

1.2.8Western印迹法 采用Western印迹法对肠黏膜组织中ZO-1，Occludin，E-cadherin，β-catenin，Claudin1中的表达进行定量检测。具体步骤：(1)取出大鼠的肠黏膜组织，立即在研磨器内加细胞裂解液放置在冰上进行研磨，持续30 min，将混合液小心吸入到离心管中；(2)将离心管置于低温高速离心机内，11 000 r/min，4℃离心，持续15 min，弃沉淀，取上清；(3)将上清液收集起来，二喹啉甲酸(BCA)法定量检测蛋白浓度，依照3∶1的比例加入上样缓冲液，再经过沸水浴持续5 min，进行灭活，在-20℃下储存，以备后续使用；(4)在110 mV下，用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行蛋白质的分离，溴酚蓝区带到达分离胶以后，电压调至200 mA，持续2 h，溴酚蓝区带进入分离胶末端，并即将泳出分离胶底部，转至硝酸纤维膜上；(5)按照20∶1的比例在磷酸盐缓冲液-吐温20溶液(PBST)溶液中加脱脂奶粉，室温条件下封闭1 h；依照一抗的推荐浓度和用量，加入奶粉对一抗进行稀释。将硝酸纤维膜置于杂交袋，加一抗工作液在袋中，然后封口，4℃条件下，孵育过夜；(6)采用辣根过氧化物酶(HRP)标记好的二抗(抗兔IgG抗体，1∶2 000稀释)工作液，再封口，37℃条件下，孵育1 h；(7)凝胶成像分析仪扫描并分析结果。绘制标准曲线，并计算浓度，结果用相对灰度值进行表示。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析、Bonferroni校正的t检验。

2 结 果

2.1各组肝组织病理学 A组肝脏细胞完整且排列整齐，肝小叶等结构清晰，肝窦清晰可见，无变性坏死，可见少量细胞脂质沉积。B组可见大量脂肪细胞变性，呈气球样变，肝小叶存在坏死灶和炎性细胞浸润及纤维间隔。C组和D组可见少量脂肪细胞变性和炎细胞浸润，但较B组明显减轻，且C组减轻更为明显。见图1。

2.2各组体重、肝湿重比较 与A组比较，B、C、D组大鼠体重和肝湿重均明显增加，且C、D组大鼠较B组体重和肝湿重明显降低(P<0.05)，但C和D组之间对比，体重无明显差异(P>0.05)，D组干湿重下降更为显著(P<0.05)。见表1。

2.3各组AST、FFA、ALT和TG水平比较 与A组比较，B、C、D组AST、FFA、ALT和TG含量均明显升高(P<0.05)；与B组相比，C、D组AST、FFA、ALT和TG含量均明显降低(P<0.05)；C和D组各血清学指标均无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组AST、FFA、ALT和TG水平比较

2.4各组肠道黏膜通透性 与A组〔(0.00±0.00)μg/ml〕比较，B、C、D组FITC-Dextran含量均明显升高〔(0.82±0.10)、(0.56±0.07)、(0.67±0.06)μg/ml，P<0.05〕；与B组相比，C、D组FITC-Dextran含量均明显降低(P<0.05)，C和D组之间对比，C组FITC-Dextran下降更为明显(P<0.05)。

2.5各组回肠组织病理学 A组小肠细胞形态正常，B组可见细胞水肿严重，大量炎性细胞浸润，能够见到坏死脱落细胞。C组、D组炎症细胞减少，水肿程度减轻，未见坏死脱落的上皮细胞，其中C组尤为明显。见图1。

2.6Western印迹检测大鼠肠黏膜组织中ZO-1，Occludin，E-cadherin，β-catenin，Claudin1蛋白表达 B、C、D组肠黏膜组织中ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin、Claudin1表达较A组明显减少，而C、D组ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin、Claudin1表达量较B组明显增加(均P<0.05)。见图2，表3。

图2 Western印迹检测肠黏膜组织ZO-1，Occludin，E-cadherin，β-catenin，Claudin1蛋白表达

表3 各组目标蛋白与GAPDH荧光强度比值

3 讨 论

胃肠道的上皮黏膜是一道具有调节和选择性渗透的屏障，可允许营养物质，离子和水被动进入，同时限制病原体进入皮下组织。肠上皮细胞的屏障功能大量生理和病理因素影响，同时受到一种顶端细胞间连接蛋白复合物的动态调节，该复合物简称AJC。AJC由紧密连接(TJ)及其下面的顶部的黏附连接(AJ)构成。AJ主要作用是防止外来抗原，微生物及其毒素等肠腔内的有害物通过，同时允许必要的电解质，营养素和水由肠腔进入机体循环系统〔10〕。TJ主要是通过调节细胞间的间隙，限制大分子和病原体的通过〔11〕。AJC发生破坏时，易引发炎症加重、感染和肠道吸收障碍等，与胃炎、肝病、腹泻及克罗恩病等多种疾病的发生发展密切相关〔12～14〕。

Claudin、Occludin及ZO家族蛋白是构成TJ的主要蛋白，而AJs的结构主要由β-catenins和E-cadherin等蛋白组成。陈景杰等〔15〕研究发现，猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)在氧化应激状态下细胞中Occludin、Claudin和ZO-1基因表达水平会明显下降。姜永帅等〔16〕通过建立大鼠脓毒症模型发现，与正常组相比，模型组大鼠肠道中Claudin-1、Occludin和ZO-1的蛋白表达水平明显减少。Yang等〔17〕研究也发现，自发性高血压神经炎性白质损伤大鼠的血管紧密连接破坏被破坏，TJ相关蛋白表达水平明显下降。边志斌等〔18〕研究发现，在结肠癌中β-catenin、c-myc表达与细胞分化呈正相关，E-cadherin表达与其呈负相关。Harosh-Davidovich等〔19〕研究也发现，直肠癌患者肠组织中的β-catenins和E-cadherin水平明显下降，且与上皮细胞间质转化密切相关。以上研究表明，AJC相关蛋白的水平改变在多种疾病的发生发展中发挥重要作用。

揉腹法作为传统中医外治法中的重要一员，可通过刺激腹部胃肠神经，调节胃肠激素分泌和免疫功能发挥治疗疾病的作用，其具有创伤小、易接受且效果确切等优势，已广泛用于慢性浅表性胃炎、小儿积滞、痛经、便秘等疾病的治疗。张玮等〔6〕通过对61例NAFLD患者分组进行治疗后发现，与西药组相比，揉腹法组患者可显著改善患者血脂和肝功能水平、提高NAFLD的临床疗效，提示揉腹法对NAFLD也具有一定的治疗作用。本研究结果证明揉腹法在治疗NAFLD中具有一定的应用前景。同时，本研究结果提示揉腹法治疗NAFLD的机制可能与激活ZO-1信号通路，促进AJC组装有关。

综上，揉腹法可改善NAFLD诱导的大鼠肝脏损伤，其机制可能可能与激活ZO-1信号通路，促进AJC组装有关。本研究虽证实揉腹法能够在一定程度上发挥治疗大鼠NAFLD作用，但由于样本量有限，实验方法单一，且NAFLD发病复杂，仍需更大的样本量、更丰富的实验方法进行验证。