星点设计-效应面法优化长春新碱长循环纳米粒的制备工艺*

封 烨，周朝阳，刘芊芊，杨 阳，李敏才

(1.湖北科技学院，湖北 咸宁 437100；2.军事科学院军事医学研究院)

长春新碱(vincristine，VCR)是夹竹桃科植物长春花中提取出的吲哚型生物碱，具有抗癌活性[1]，抗肿瘤较谱广，尤其对淋巴细胞系白血病以及恶性淋巴瘤疗效较好，对生殖细胞肿瘤、黑色素瘤、小细胞肺癌、尤文氏肉瘤、消化道癌及多发性骨髓瘤的治疗也有良好效果[2-3]。但是其神经系统毒性与剂量的累积高度相关，并且对局部组织有刺激性，这些缺陷往往限制了该药物的使用[4]。VCR进入体内后其血液浓度迅速下降，而且很快分解，在体内的分布广泛，缺乏特异性，这些都对药物的治疗效果有很大的影响[5]。

近些年人工合成药物载体—纳米药物递送系统，以载药率高、控释能力好、靶向性强等优势被众多研究人员关注[6-7]，尤其是聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]纳米粒，由于其良好的生物相容性和生物可降解性广泛地被用作纳米递药系统的载体材料。因此，本课题选用抗癌药物VCR，用PLGA作为载体材料，采用沉淀法制备VCR长循环纳米粒(VCR-NPs)，并采用星点设计-效应面法对制备工艺进一步优化，改善该药物的制备工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

PLGA(75/25相对分子质量15 000，西安瑞禧生物科技有限公司)；VCR对照品(自制)；VCR原料药(自制)；乙腈(色谱纯，美国Dikma公司)；甲醇(色谱纯，美国Dikma公司)；二乙胺(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

Agilen 1200型高效液相色谱仪(Agilent Technologie，UV检测器，四元泵)；ZORBAXSB-C8柱(4.6×250mm，5μm，美国Agilent公司)；BT25S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；3K-15台式高速冷冻离心机(德国SIGMA)；X85-2S恒温磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；PSA 1190激光粒度分析仪(安东帕上海商贸有限公司)；Hitach-7650透射电子显微镜(Hitachi Limited)。

1.2 方法

1.2.1 VCR-NPs制备方法[8]

精密称取VCR 4mg及PLGA 20mg，加入丙酮2mL溶解混合，然后滴加入 4mL水相中，边滴加边搅拌，并持续在室温下搅拌1h。使有机相均匀分散在水相中，形成淡蓝色乳光混悬液。将该混悬液置于真空旋转蒸发仪挥干，水浴温度40℃，3000rpm、10min离心以除去沉淀，即可得到VCR-NPs混悬液。

1.2.2 HPLC分析方法建立

(1)色谱条件。参考《中国药典》2015版[8]，色谱柱为ZORBAXSB-C8柱(4.6×250mm，5μm)；检测波长为297nm；流动相为甲醇∶二乙胺水溶液(用磷酸调pH至7.5)=70∶30；进样量20μL；柱温30℃；流速1mL/min。

(2)对照品溶液的制备。称取VCR对照品(纯度98%)适量，精密称定2.01mg，置于5mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀释并定容至刻度，摇匀，制成浓度为402μg/mL的VCR对照品溶液，作为储备液。

(3)供试品溶液的制备。精密量取VCR-NPs混悬液1mL，置5mL容量瓶中，加乙腈2mL，超声5min，使VCR-NPs溶解，加入甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过后，作为供试品溶液。

(4)专属性考察。精密量取空白纳米粒及VCR-NPs溶液及VCR对照品溶液各1mL，按照(3)项方法制备空白样品溶液和供试品溶液。按照(1)项色谱条件进行高效液相测定，记录图谱。

(5)标准曲线绘制。精密量取VCR对照品储备液，用流甲醇稀释成浓度为1000、500、300、200、100、50、10μg/mL一系列溶液，按照(1)项色谱条件测定，以对照品溶液浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线。

(6)精密度试验。精密吸取VCR对照品溶液，按照(1)项色谱条件重复进样6次，计算RSD值。

(7)重复性试验。精密量取同一批VCR-NPs混悬液6份，按(3)项方法制备供试品溶液，按照(1)项色谱条件进行测定，计算VCR含量的RSD值。

(8)稳定性试验。精密吸取同一供试品溶液，在0、2、4、6、8、10、12h内按照(1)项液相方法进行测定，计算VCR的峰面积RSD值。

(9)回收率试验。精密量取100μg/mL对照品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，加入空白纳米粒混悬液1mL，加乙腈2mL，超声5min，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过后，作为供试品溶液，平行制备6份，按照(1)项方法测定VCR含量，记录峰面积，计算回收率及其RSD值。

(10)定量限和检测限。精密称定硫酸VCR对照品适量，配制成一系列3、30、10、5、3、1ng/mL低浓度VCR对照品溶液，按(1)项色谱条件测定其信号。检测限是信号值/基线噪声值为3∶1时所对应的浓度。定量限是信号值/基线噪声值为10时所对应的浓度。

1.2.3 载药量与包封率的测定[9-10]

取适量VCR-NPs冻干粉末，用乙腈完全溶解并超声5min进行破碎，用超滤离心管离心，离心条件12000rpm，10min，收集下层，按1.2.2(1)项色谱条件进样检测，测出药物的总含量Wtotal；取另一份VCR-NPs冻干粉用PBS缓冲溶液(pH7.4)完全溶解，用超滤离心管离心，离心条件12000rpm，10min，收集下层溶液，按1.2.2(1)项色谱条件进样检测，测出游离药物含量Wfree。按以下公式进行包封率及载药量的计算：

(Wtotal：VCR纳米粒中药物总含量；Wfree：游离药物含量；WNP：纳米粒中所载的VCR和辅料量总和)

1.3 星点设计-效应面法优化VCR-NPs的制备工艺

1.3.1 VCR-NPs处方单因素考察

根据单因素考察，选取对VCR-NPs制备影响较大的3个因素，即以VCR的用量(X1)、水相体积(X2)以及PLGA的用量(X3)作为考察对象。根据付诗瑶[9]相关实验研究结合预实验确定筛选范围分别为X1：2～6mg，X2：2～6mL，X3：10～30mg，并以粒径(Y1)与包封率(Y2)作为评价指标对制备工艺进行优选。

1.3.2 数学模型拟合及效应面优化

应用Design-ExpertV 8.0.6.1软件对实验数据进行拟合，得出模型回归系数的显著性检验结果以及方差分析结果，以P<0.01表示高度显著，以P<0.05表示显著。VCR用量(A)、水相用量(B)、PLGA用量(C)进行模型拟合，得到粒径及包封率的拟合方程。

1.3.3 优化处方验证

根据最优处方制备样品计算偏差，偏差=(预测值-实际值)/预测值×100%。

1.4 VCR-NPs物理性质考察

1.4.1 粒径与Zeta电位测定

VCR-NPs粒径和电位经激光粒度分析仪测定。

1.4.2 VCR-NPs形态学观察[11-13]

取适量VCR-NPs溶液，稀释后，经0.45μm滤膜滤过，将其滴在覆盖碳膜的100目铜网上，并自然干燥3min，用滤纸吸去剩余的溶液，再用2%磷钨酸溶液进行负染，吸去剩余的磷钨酸溶液，在透射电子显微镜下观察VCR-NPs的形态。

2 结 果

2.1 HPLC分析方法

2.1.1 专属性考察

实验结果见图1(封二)。结果表明，VCR与PLGA材料分离情况良好，说明本方法专属性良好。

2.1.2 绘制标准曲线

以对照品溶液浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，其线性回归方程为Y=16.556X-183.08，r2=0.9992，表明VCR在1000～10μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 精密度试验

精密度实验结果RSD值为0.91%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 重复性试验

重复性实验结果计算VCR含量的RSD值为0.72%，说明该方法重现性良好。

2.1.5 稳定性试验

稳定性试验结果VCR的峰面积RSD值为0.67%，说明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.1.6 回收率试验

按照回收率试验方法测定VCR含量，记录峰面积后，计算回收率为99.8%，RSD值为0.70%。

2.1.7 定量限和检测限

检测限是信号值/基线噪声值为3∶1时所对应的浓度。定量限是信号值/基线噪声值为10时所对应的浓度。测得最低检测限浓度为3ng/mL，最低定量限浓度为10ng/mL。

2.2 星点设计-效应面法优化VCR-NPs的制备工艺

2.2.1 VCR-NPs 处方单因素考察

筛选范围分别为X1：2～6mg，X2：2～6mL，X3：10～30mg，并以粒径(Y1)与包封率(Y2)作为评价指标对制备工艺进行优选，各考察因素及其水平的具体取值见表1，应用Design-Expert.V8.0。6.1软件对实验数据进行实验设计见表2。

表1 因素水平表

表2 星点设计实验及结果

2.2.2 数学模型拟合及效应面优化

应用Design-Expert.V8.0.6.1软件对实验数据进行拟合，模型回归系数的显著性检验结果见表3～4。方差分析结果以P<0.01表示高度显著，以P<0.05表示显著。VCR用量(A)、水相用量(B)、PLGA用量(C)进行模型拟合，得到粒径及包封率的拟合方程为：

粒径=176.18+14.01A-11.46B+24.90C-9.28AB+14.65AC-1.00BC-27.28A2-3.98B2-10.75C2

包封率=83.31+3.72A+11.32B-3.09C-5.33AB+3.00AC-7.45BC+5.79A2-10.64B2-6.30C2

由结果可知，对于粒径，C、A2项极显著，A、B、AC项显著，其他项不显著，见表3；对于包封率，B、BC、A2、B2、C2项极显著；A、C、AB、AC项显著，其他项不显著，见表 4。采用Design-Expert.V8.0.6.1 软件，依据所拟合的数学模型绘制相应效应面图，结果见图2～7(封二)，分析每一个效应面中考察因素的交互作用，筛选出各考察因素的最佳取值。根据预测结果，并结合实际情况，最终确定VCR-NPs的制备工艺为：VCR用量4mg，水相体积4mL，PLGA 20mg。

表3 响应面模型对粒径的方差分析结果

表4 响应面模型对包封率的方差分析结果

2.2.3 优化处方验证

根据最优处方制备3批样品，平均粒径为177.9nm、平均包封率为81.39%、平均载药量为6.32%。计算偏差，结果见表5，表明测定值与预测值的相对偏差较小，各项指标偏差均小于±5%，说明优化后的处方验证试验所测出的粒径、包封率的测定值与预测值基本一致，工艺重复性好，证明星点设计-效应面法有良好的预测效果，制备工艺可行。

表5 比较模型预测值和实验测定值

2.3 VCR-NPs物理性质考察

2.3.1 粒径与Zeta电位测定

VCR-NPs粒径和电位经激光粒度分析仪测定，其平均粒径为177.9nm，分散指数(PDI)为0.12，粒径呈正态分布，Zeta电位为-30.7mV，说明所制备的纳米粒具有良好的稳定性和分散性。结果见图8～9。

图8 VCR-NPs粒径分布

图9 VCR-NPs的Zeta电势图

2.3.2 VCR-NPs形态学观察

电子显微镜下观察VCR-NPs的形态，结果可见VCR-NPs呈现类圆球形。见图10。

图10 VCR-NPs透射电镜扫描图片(×30000)

3 讨 论

目前癌症已成为人类全球第一位的致死病因，而化疗是现如今治疗恶性肿瘤的主要方式，但是化学药物在杀伤癌细胞的同时对正常细胞同样具有毒性作用，从而对组织器官造成不可逆的损伤[14]。现如今可用于临床治疗恶性肿瘤的化疗药物超过40种，因此，改良药物剂型，提高化学药物的治疗靶向性，已成为药学研究人员的重要课题[15]。纳米载体具有毒性低、可生物降解、生物相容性良好等优势被广泛用于化疗药物载体的研究开发。

VCR是已上市化疗一线用药，临床应用会引起低钠血症、神经毒性等毒副作用[16-17]。本研究通过纳米沉淀法制备了VCR-NPs，该方法操作简单，实际应用性强，故采用此法。并通过星点设计-效应面法对该制备工艺进行优化，通过数据拟合，绘制三维效应面，从而在控制纳米粒粒径的同时提高药物包封率，预测出最优值，得到最佳制备工艺为VCR 4mg，PLGA 20mg，加入丙酮2mL溶解混合后，滴加到4mL水相中，持续在室温下搅拌1h后，将该混悬液置于真空旋转蒸发仪中，水浴温度40℃将丙酮挥干即可。经优化后VCR-NPs平均粒径为177.9nm，平均包封率为81.39%，平均载药量为6.32%，Zeta电位为-30.7mV，具有良好的稳定性和分散性。在验证试验中各指标平均实测值与模型预测值的偏差<5%，说明该模型预测准确可靠，且重现性良好，为VCR-NPs的进一步研究开发提供了实验依据。