3,5-二硝基水杨酸法测定液体糖中总糖含量

詹梦涛,娄水珠,刘仙花,洪耀强,杨海英,杜 刚

(1.云南民族大学 民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室,云南 昆明 650500；2.云南民族大学 化学与环境学院,云南 昆明 650500)

液体糖是以白砂糖、绵白糖、精制的糖蜜或中间制品为原料,经加工或转化工艺制炼而成,根据其中还原糖的含量不同可分为全蔗液体糖和转化液体糖[1].液体糖作为白砂糖的替代品应用于食品工业,在欧美国家液体糖的生产和应用已有悠久的历史.随着国内饮料食品行业的发展,对液体糖的需求也在不断增长.

液体糖中的总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性单糖的蔗糖、麦芽糖等.还原糖和总糖含量是影响液体糖质量和区分种类的重要指标之一.目前,我国于2011年实施的QB/T 4093—2010液体糖轻工业行业标准中[1],规定转化糖浆的还原糖测定方法按照QB/T2343.2—1997标准[2]或者GB/T18932.22—2003 标准[3].QB/T 2343.2—1997标准中还原糖的测定方法为兰-艾农恒容滴定法,操作步骤繁琐、影响因素多,同时本试验液体糖样品本身颜色较深,滴定终点受干扰肉眼很难判定；而GB/T18932.22—2003 标准中还原糖为高效液相色谱示差折光检验方法,设备费用高、测样周期长,不适合大批量的样品测定,用于测量全蔗糖糖浆的还原糖含量存在较大误差[4],也不适合转化糖浆中还原糖的测定[5].3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)比色法是测定还原糖的经典方法,操作简便快速,设备要求简单,适宜批量检测.由于没有还原性的双糖和多糖可以通过酸水解彻底水解成有还原性的单糖,DNS法也广泛用于中药材、葡萄酒等样品水解后总糖的含量测定[6-10].

本文以市售液体糖为原料,利用盐酸将糖浆中总糖水解为还原糖,碱性条件下还原糖将DNS中的硝基还原成桔红色氨基化合物,氨基化合物在一定波长下的吸光度与还原糖含量存在线性关系从而计算总糖含量[11]考察了检测波长、显色剂用量、沸水浴加热时间、显色时间等还原糖的检测条件,对液体糖中总糖的水解条件进行优化,首次建立DNS法检测液体糖中总糖含量的方法,并做了相应的方法学考察研究,以期为液体糖的研发和生产提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

某品牌液体糖,购自本地超市.

D-无水葡萄糖对照品(分析纯)：风船化学试剂科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸(分析纯)：津东天正精细化学试剂厂；氢氧化钠、无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠(均为分析纯)：风船化学试剂科技有限公司；盐酸(分析纯)：重庆川东化工有限公司；浓硫酸(分析纯)：成都市科龙化工试剂厂.

1.2 仪器与设备

UV-9000紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；METTLERTOLEDO LE204E型精密电子天平：美特勒-托利多仪器上海有限公司；100～1 000 μL 移液枪：普兰德(上海)贸易有限公司；HH-S2 电热恒温水浴锅：江苏大地自动化仪器厂；BCD-218ZM2冰箱：合肥美菱股份有限公司.

1.3 溶液的配制

DNS试剂的配制[12]：称取3,5-二硝基水杨酸3.15 g ,量取2 mol/L NaOH 溶液131 mL,加至250 mL含有 92.5 g酒石酸钾钠的热水溶液中,加入 2.5 g苯酚和 2.5 g 亚硫酸钠,溶解后冷却至室温,用蒸馏水定容至 500 mL.贮存于棕色瓶中,放置一周后使用.

葡萄糖标准溶液的配制：准确称取无水葡萄糖0.1 g,加蒸馏水定容至100 mL容量瓶中,备用.

液体糖样品溶液：准确称取液体糖样品1 g,加蒸馏水稀释,摇匀,定容至250 mL容量瓶中备用.

1.4 检测条件的优化

1.4.1 检测波长考察

取4支25 mL具塞比色管编号分别为1、2、3、4.

1：精密吸取1.5 mL蒸馏水,加1.5 mL DNS试剂；

2：精密吸取1.0 mL液体糖样品溶液,加入2 mol/L盐酸0.5 mL,50 ℃水浴加热5 min进行酸水解,酸水解后冷却,用 2 mol/L 的 NaOH 溶液中和,加1.5 mL DNS试剂；

3：精密吸取1.0 mL液体糖样品溶液,加入2 mol/L 盐酸 0.5 mL,50 ℃水浴加热 5 min进行酸水解,酸水解后冷却,用 2 mol/L 的 NaOH 溶液中和,加1.5 mL蒸馏水；

4：精密吸取1 mg/mL葡萄糖标准品溶液 1.0 mL,分别加入1.5 mL DNS试剂、0.5 mL蒸馏水.

1、2、3、4比色管置于沸水浴中反应7 min,迅速冷却至室温,摇匀,定容至刻度,显色30 min；1、3两组以蒸馏水作参比,2、4两组以DNS试剂-水(1号)作参比,在波长400～700 nm范围内进行光谱扫描,每隔1 nm采集吸光度数据.分析光谱扫描图,确定检测波长.

1.4.2 DNS法检测条件的考察

25 mL比色管中分别加入1 mL 1 mg/mL葡萄糖溶液,考察显色剂添加量(0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4、2.7 mL)、沸水浴加热时间(1、3、5、7、9、11 min)、显色时间(10、20、30、40、50、60 min)在1.4.1 确定波长下检测吸光度值.

1.5 液体糖总糖水解条件考察

在利用 DNS 法测定总糖时,酸水解时既要保证多糖 100% 水解,也要避免果糖等在酸水解过程中进一步被降解[13].影响水解的因素主要有水解时间、水解温度、酸的添加量.本实验选择2 mol/L 的盐酸溶液作为水解液体糖糖类的酸,试验考察的因素为水解时间、水解温度及盐酸添加量3个因素.酸水解条件设置见表 1.

表1 酸水解条件

1.6 标准曲线的绘制

分别精密吸取1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液0.10、0. 20、0.40、0.60、0.80、1、1.2、1.4 mL加入25 mL 比色管中,加入1.5 mL的DNS,加蒸馏水至10 mL,在沸水浴中加热7 min,迅速冷却,定容,显色30 min.以 DNS-水溶液为空白,在 1.4.1 确定波长下测定吸光度.以葡萄糖质量浓度(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线.

1.7 总糖含量的测定及计算方法

精密量取液体糖样品溶液1 mL于25 mL比色管中,加入2 mol/L盐酸0.5 mL(糖液与酸液体积比为1∶0.5),放入50 ℃恒温水浴锅中加热5 min进行酸水解,酸水解后冷却,用 2 mol/L 的 NaOH 溶液中和,加 1.5 mL DNS溶液,摇匀后在沸水浴中加热7 min,迅速冷却,定容,显色30 min. 以DNS试剂-水为空白对照,测定吸光度.按下式计算样品中总糖的百分含量(以葡萄糖计)[11]：

总糖含量(%)=(ρ×V÷M) ×0.9 ×100

式中ρ为葡萄糖标准曲线方程计算所得液体糖中葡萄糖的质量浓度(mg/mL)；V为液体糖稀释定容的体积(mL)；M为液体糖样品毫克数,0.9为以葡萄糖计算液体糖总糖含量的换算系数.

2 结果与分析

2.1 检测条件优化结果分析

2.1.1 检测波长的选择

根据1.4.1步骤,分别将1、2、3、4比色管在波长400～700 nm范围内进行光谱扫描,光谱扫描图如图1.

从图 1 中可以看出,葡萄糖溶液-DNS(4)与液体糖样品-DNS(2)的最大吸收波长为491 nm.但DNS 试剂(1)在此处也有较强的吸收,使得样品在 491 nm 处的测定干扰严重.当波长为500 nm时,DNS-水(1)与液体糖样品-水(3)的吸收较小,对样品测量干扰较小.综合考虑选择测定波长为500 nm.与文献中采用的波长480、520、530、540 nm[9-10,14-15]不同.

2.1.2 显色剂用量的确定

由图2可知,显色剂DNS用量在0.3～1.5 mL范围时,吸光度呈上升趋势,当用量达到1.5 mL 时,吸光度达到最大值；在1.5～2.7 mL范围时,吸光度值基本不变.显色剂DNS的用量确定为1.5 mL.

2.1.3 沸水浴加热时间考察

图3结果显示,当沸水浴加热时间为7 min时反应完全,吸光度有最大值,7 min以后,吸光度值基本不变,确定7 min为沸水浴加热时间.

2.1.4 显色时间的选择

考察显色时间对葡萄糖溶液在波长500 nm处吸光度值的影响,结果如图4.由图4可知,当显色时间到30 min时,吸光度有最大值,30 min后吸光度值基本稳定,选择30 min 为最终显色时间.

2.2 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线如图5所示.标准曲线的线性回归方程为：y=0.709x-0.047,R2=0.999,在0.1～1.4 mg/mL质量浓度范围内线性关系良好.

2.3 总糖水解条件优化结果与分析

2.3.1 盐酸添加量的考察

图6结果显示,当盐酸用量为0.5 mL时,吸光度值达到最大,盐酸用量大于0.5 mL时,吸光度值反而有所下降,参照文献[13].此时可能部分果糖降解引起吸光度值下降.确定盐酸用量为0.5 mL(糖液与酸液体积比为1∶0.5).

2.3.2 酸水解温度的考察

由图7可知,当酸水解温度为50 ℃时,吸光度达到最大,表明此时多糖水解完全,选择50 ℃为最终酸水解温度.

2.3.3 酸水解时间的考察

图8结果显示,当酸水解时间为0～5 min时,溶液的吸光度值不断增大；当沸酸水解时间超过 5 min 时,吸光度值迅速下降,表明酸水解时间对吸光度的测量影响较大.最终确定酸水解时间为5 min.

2.4 总糖含量的测定及计算

按照1.7步骤对液体糖样品中的总糖含量进行测定及计算,结果表明液体糖样品中总糖含量为69.65%(n=3).

2．5 方法学考察

2.5.1 精密度试验

精密移取1mL液体糖样品溶液于6份25 mL具塞比色管中,按照1.7方法处理,测定吸光度.测定结果相对标准偏差为1.62%.

2.5.2 重复性试验

分别称取6份约1 g 的液体糖样品于250 mL 容量瓶中,定容,按照1.7方法测定样品溶液的吸光度,计算液体糖样品中总糖的百分含量.计算结果相对标准偏差为2.18%.

2.5.3 稳定性试验

移取液体糖样品溶液1.0 mL于25 mL具塞比色管中,按照1.7方法测定样品溶液的吸光度,每隔5 min 测定1次吸光度.吸光度6次检测结果相对标准偏差为1.91%.表明用DNS法测定液体糖总糖含量在30～60 min内显色稳定.

2.5.4 加标回收率试验

精密吸取液体糖溶液5份各1 mL,分别加入5份不同体积的1.0 mg/mL葡萄糖溶液,进行加标回收率试验,按照1.7方法测定样品溶液的吸光度,计算回收率及相对标准偏差,结果如表2所示.总糖含量检测结果回收率在96.90%～104.37%,平均回收率为99.56%,RSD值为3.16%.

表2 加标回收率试验结果

3 结语

本文对液体糖中还原糖的检测条件和总糖的水解条件进行了优化,建立了3,5-二硝基水杨酸法测定液体糖中总糖含量.确定DNS法测定液体糖中还原糖的检测条件为：检测波长500 nm,沸水浴加热7 min,DNS显色剂1.5 mL,显色时间 30 min；总糖的水解条件为：糖液样品与 2 mol/L 盐酸体积比为1∶0.5, 50 ℃水解5 min. 标准品葡萄糖在0.1～1.4 mg/mL 范围内呈良好的线性关系,相关系数R2=0.999； 试验精密度、重复性和稳定性试验结果的相对标准偏差均小于3%,平均加标回收率为99.56%,RSD值为3.16%.结果表明方法可用于检测液体糖中总糖含量.