不同品种(品系)棉花对盐胁迫的生理响应及耐盐性评价

石 婧， 刘东洋， 张凤华

(1.石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003； 2.石河子大学农学院/绿洲生态农业兵团重点实验室，新疆 石河子 832003)

盐渍化是全球性的土壤环境问题，当前由于不合理的灌溉制度和施肥措施等，导致土壤盐渍化程度加剧，从而降低了农作物产量[1]。全世界大约有4×108hm2盐碱地，分布在一百多个国家[2]，其中中国大约有9.2×107m2盐碱地，并且面积还在日益扩大[3]。如何开发利用这些土地资源是目前中国乃至世界面临的难题。棉花作为重要的经济作物，常常作为盐碱地开垦过程中的先锋作物[4]，尽管棉花被认为是中度耐盐作物，但是其耐盐程度仍然受到遗传和发育阶段的影响[5]。因此，研究棉花在盐碱地环境下的自我保护机制是筛选耐盐棉花品种的重要途径之一。

目前已有较多关于棉花耐盐性的研究，例如有研究发现，在盐胁迫下，棉花幼苗中的可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量、丙二醛含量均有所增加[6]，棉花还可通过合成脯氨酸(Pro)来提高细胞渗透压[7]，并且在盐胁迫下棉花植株体内的抗氧化系统发生了变化，棉花植株通过提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性来维持膜结构和功能的稳定性[8-9]。也有研究发现，在盐胁迫环境下，棉花的保护酶活性有所下降[10]。在盐胁迫下，由于存在大量Na+，往往造成外部高Na+浓度、低K+浓度的离子不平衡现象，细胞一般通过保持组织内较高的K+/Na+来维持自身的稳态。相关研究发现，耐盐性较强的棉花品种往往比耐盐性弱的棉花品种具有更高的K+/Na+[11-12]。Na+的大量积累同样会造成净光合速率的降低[13]，然而也有研究者认为，净光合速率的降低主要受气孔因素和非气孔因素的影响[14]。由于棉花耐盐性受渗透调节物质、离子平衡、氧化应激、光合特性等多方面的影响，并且其中某些特定组成部分可能起着至关重要的作用，因此使用某些单项指标很难准确全面地比较棉花品种间的耐盐性，需要通过多指标综合评价的方法来筛选耐盐棉花品种，而主成分分析法与灰色关联度分析法的结合能够客观、综合地评价棉花的耐盐性[15-16]。

本研究采用田间微区控制试验，分析盐胁迫条件下耐盐棉花与盐敏感棉花在渗透调节、离子平衡、氧化应激和光合作用等方面的差异，运用主成分分析法和灰色关联度分析法对4个棉花品种(品系)的耐盐性进行综合评价，以期筛选出鉴定棉花耐盐性的重要指标，为开发适应盐渍化土壤的耐盐棉花品种(品系)和在生产实际上更加简便地评价棉花的耐盐性提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验区概况与试验材料

本试验在新疆生产建设兵团第八师石总场四分场6连进行，该区域属于典型的温带大陆性气候，年平均气温为7.5～8.2 ℃，年平均降水量为180 mm，年平均蒸发量为1 600 mm，年平均日照时数为2 784 h，年平均无霜期为166 d，≥0 ℃积温为3 918 ℃。试验地土壤中度盐渍化，土壤透气、透水性差。试验地基础理化性质如下：pH值为8.46，电导率为801.27 μS/cm，全盐含量为10.23 g/kg，碱解氮含量为54.25 mg/kg，速效磷含量为4.82 mg/kg，速效钾含量为293.00 mg/kg，有机质含量为3.98 g/kg。供试棉花品种(品系)为耐盐品种中H177、耐盐品系中J0710与盐敏感品种中J0102、盐敏感品种新陆早74，前3个棉花品种(品系)及其耐盐性数据由中国农业科学院棉花研究所提供。

1.2 试验设计

采用田间微区试验方法，先人工铺膜，之后进行点播。于2019年4月29日播种，采用1膜3管6行地膜覆盖栽培，株距为10 cm。每个棉花品种(品系)设为1个处理，每个处理设2次重复，共计8个微区，本试验微区采用随机区组方式排列，每个微区长2.05 m、宽2.00 m，每个微区的面积为4.10 m2，微区周围设置0.5 m宽保护行，栽培管理措施与一般棉田一致。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 叶绿素SPAD值与光合指标的测定 于棉花出苗后5叶期测定叶绿素SPAD值及光合参数，叶绿素SPAD值用日本柯尼卡美能达SPAD-502叶绿素仪测定，光合指标用LI-6400便携式光合仪测定，包括净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)，光照度设为1 200 μmol/(m2·s)。选择晴朗无云的天气进行测定，从9∶00开始，选取各小区棉花的功能叶(倒三叶)进行测定，各处理连续测定6株，取平均值。

1.3.2 生理生化指标的测定 测定棉花的叶绿素SPAD值、光合指标后进行棉花植株的取样，将棉花植株放入装有干冰的泡沫盒中带回实验室，清洗干净后用吸水纸将其表面水分吸干，将一部分棉花植株研磨，用于测定生理生化指标，将另一部分棉花植株先于105 ℃杀青30 min，再于80 ℃烘干以测定其Na+、K+含量。

用考马斯亮蓝G-250染色法测定棉花植株中可溶性蛋白质含量；用蒽酮比色法测定棉花植株中可溶性糖含量；用茚三酮比色法测定棉花植株中脯氨酸含量；用硫代巴比妥酸比色法测定棉花植株中丙二醛含量；用氮蓝四唑光还原法测定棉花植株中超氧化物歧化酶活性；用愈创木酚-过氧化氢法测定棉花植株中过氧化物酶活性；用紫外吸收法测定棉花植株中过氧化氢酶活性[17]；Na+、K+含量用离子色谱仪测定[18]。

1.4 分析方法

采用灰色关联度分析法进行分析。按照灰色理论系统，将4个棉花品种(品系)看作1个灰色系统，每个棉花品种(品系)是该系统中的1个因素。设有i个棉花品种(品系)、j个指标，将各棉花品种(品系)的各指标构成设为比较数列Xi，各指标用k表示。其中丙二醛含量、Na+含量的测量值越小越好，采用下限效果测度变换，其他指标采用上限效果测度变换。相关计算公式如下：

(1)

式中，wj为第j个综合指标的重要程度(即权重)，pj为棉花品种(品系)第j个综合指标的贡献率。

对棉花品种(品系)指标的原始数据进行无量纲化处理，采用效果测度变换，上限效果测度变换公式如下：

Lij=Xij/Xmax(Xij≤Xmax)

(2)

式中，Lij为第i个棉花品种(品系)第j个指标的标准值，Xmax为指标中的最大值，Xij构成样本评价矩阵。

下限效果测度变换公式如下：

Lij=Xmin/Xij(Xij≥Xmin)

(3)

式中，Lij为第i个棉花品种(品系)第j个指标的标准值，Xmin为指标中的最小值，Xij构成样本评价矩阵。按下式计算各棉花品种(品系)指标序列值与最优序列值的差[△i(k)]：

△i(k)=|1-Lij|

(4)

其他相关计算公式：

(5)

(6)

(7)

1.5 数据处理

用Excel 2017对试验数据进行整理、绘图并计算灰色关联度，用SPSS 20.0软件进行方差分析与主成分分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对不同品种(品系)棉花叶片渗透调节物质的影响

本研究发现，盐胁迫对不同品种(品系)棉花叶片可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量和脯氨酸含量的影响有差异。由图1A可以看出，棉花叶片可溶性蛋白质含量以盐敏感品种新陆早74和耐盐品系中J0710最高，两者间无显著差异，并且这2个棉花品种(品系)叶片可溶性蛋白质含量均显著高于其他棉花品种，叶片可溶性蛋白质含量较高的还有耐盐棉花品种中H177，而盐敏感棉花品种中J0102的叶片可溶性蛋白质含量最低。由图1B、图1C可以看出，各棉花品种(品系)叶片可溶性糖含量与脯氨酸含量均表现出显著差异(P<0.05)，盐敏感棉花品种新陆早74叶片可溶性糖含量最高，并且显著高于其他棉花品种(品系)，而盐敏感棉花品种中J0102叶片可溶性糖含量显著低于其他棉花品种(品系)(P<0.05)；耐盐棉花品种中H177叶片脯氨酸含量最高，其次为耐盐棉花品系中J0710，这2个棉花品种(品系)的脯氨酸含量均显著高于盐敏感棉花品种新陆早74和中J0102。

2.2 盐胁迫对不同品种(品系)棉花叶片叶绿素SPAD值和丙二醛含量的影响

如图2A所示，不同品种(品系)棉花叶片的叶绿素SPAD值存在差异，耐盐棉花品系中J0710叶片的叶绿素SPAD值最高，显著高于其他棉花品种(P<0.05)，其次为耐盐棉花品种中H177。此外，耐盐棉花品种(品系)的叶绿素SPAD值均明显高于盐敏感棉花品种，盐敏感棉花品种中J0102叶片的叶绿素SPAD值最低。由图2B可以看出，不同品种(品系)棉花叶片的MDA含量间存在显著差异(P<0.05)，盐敏感棉花品种中J0102叶片的MDA含量最高，其次为盐敏感棉花品种新陆早74，表明盐敏感棉花品种的膜损伤程度较为严重，而耐盐棉花品种(品系)中H177、中J0710的叶片MDA含量低。

A：可溶性蛋白含量；B可溶性糖含量；C：脯氨酸含量。不同处理间标有不同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。图1 盐胁迫对不同品种(品系)棉花叶片渗透调节物质的影响Fig.1 Effects of salt stress on osmotic regulating substances in leaves of different cotton cultivars(strains)

A：SPAD值；B:丙二醛含量。不同处理间标有不同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。图2 盐胁迫对不同品种(品系)棉花叶片SPAD值及丙二醛含量的影响Fig.2 Effects of salt stress on soil and plant analyzer development (SPAD) value and malondialdehyde (MDA) content in leaves of different cotton cultivars(strains)

2.3 盐胁迫对不同品种(品系)棉花叶片光合特性的影响

本研究发现，耐盐棉花品种(品系)和盐敏感棉花品种间的光合特性有一定差异。由图3A可以看出，耐盐棉花品系中J0710叶片的Pn最高，显著高于其他棉花品种(P<0.05)，耐盐棉花品种中H177和盐敏感棉花品种中J0102间的叶片Pn无显著差异，但二者均显著高于盐敏感品种新陆早74。由图3B、图3C、图3D可以看出，各棉花品种(品系)间在叶片Gs、Ci和Tr上的差异基本相似，均表现为耐盐棉花品种(品系)较高，盐敏感棉花品种较低。耐盐棉花品种(品系)中H177和中J0710、盐敏感棉花品种中J0102的Gs、Ci均显著高于盐敏感棉花品种新陆早74(P<0.05)；耐盐棉花品种(品系)间的Tr无显著差异，盐敏感棉花品种间的Tr也无显著差异,并且耐盐棉花品种(品系)的Tr均显著高于盐敏感棉花品种(P<0.05)。

2.4 盐胁迫对不同品种(品系)棉花叶片抗氧化酶活性的影响

本研究发现，不同棉花品种(品系)间的抗氧化酶活性有一定差异。由图4A可以看出，耐盐棉花品种(品系)中H177、中J0710和盐敏感棉花品种新陆早74间的SOD活性无显著差异，但均显著高于盐敏感棉花品种中J0102(P<0.05)。由图4B可以看出，在POD活性方面，耐盐棉花品系中J0710和盐敏感棉花品种中J0102叶片的POD活性最高，两者间无显著差异，且两者均显著高于其他棉花品种(P<0.05)。由图4C可以看出，盐敏感棉花品种(新陆早74和中J0102)叶片中的CAT活性显著高于耐盐棉花品种(品系)(中H177和中J0710)(P<0.05)。

A：净光合速率；B：气孔导度；C：胞间CO2浓度；D：蒸腾速率。品种(品系)间标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图3 盐胁迫对不同品种(品系)棉花叶片光合特性的影响Fig.3 Effects of salt stress on photosynthetic characteristics in leaves of different cotton cultivars(strains)

A：超氧化物歧化酶(SOD)活性；B：过氧化物酶(POD)活性；C：过氧化氢酶(CAT)活性。品种(品系)间标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图4 盐胁迫对不同品种(品系)棉花叶片抗氧化酶活性的影响Fig.4 Effects of salt stress on antioxidant enzyme activities in leaves of different cotton cultivars(strains)

2.5 盐胁迫对不同品种(品系)棉花Na+、K+含量的影响

如表1所示，在盐胁迫环境下，耐盐棉花品种中H177叶片、根中Na+含量显著高于其他棉花品种(品系)(P<0.05)，耐盐棉花品系中J0710茎中Na+含量显著高于其他棉花品种。耐盐棉花品种中H177各器官中K+含量、K+/Na+均显著高于其他棉花品种(品系)(P<0.05)，而盐敏感棉花品种中J0102叶、茎中K+/Na+显著低于其他棉花品种(品系)(P<0.05)，但根中K+/Na+与耐盐棉花品系中J0710无显著差异。

2.6 主成分分析和灰色关联度分析

对4个棉花品种(品系)中H177、新陆早74、中J0710和中J0102受盐胁迫后的21个指标进行主成分分析。结果表明，第1主成分(PC1)、第2主成分(PC2)和第3主成分(PC3)特征值均大于1，主成分特征值中3个成分的累积方差贡献率达到85.63%。将原来的21个单项指标转换为3个相互独立的主成分，并对数据进行极差法标准化处理后，根据公式(1)计算权重。由表2可以看出，本研究测定的21个评价指标中权重系数较大的为MDA含量、SPAD值、CAT活性、Pn、Gs、Ci、Tr。

表1 盐胁迫对不同品种(品系)棉花各器官Na+、K+含量的影响

对数据进行无量纲化处理，并根据公式(5)、公式(6)和公式(7)的计算结果得到各指标的权重。根据灰色关联度分析方法计算得出，各指标的权重系数中较大的为可溶性蛋白质含量、SPAD值、POD活性、Pn、Gs、Ci和Tr(表2)。计算各棉花品种(品系)的灰色综合评价值，由表3可见，4个棉花品种(品系)的关联度为0.66～0.81，其中中H177的关联度最高，为0.81，中J0102的关联度最低，为0.66；根据ri′对棉花品种(品系)进行耐盐性评价排序：中H177>中J0710>新陆早74>中J0102。

表2 不同棉花品种(品系)的单项指标权重系数

表3 供试棉花品种(品系)指标的关联度及排序

3 讨 论

3.1 不同耐盐棉花品种(品系)渗透调节系统和抗氧化酶系统的差异

一般来说，植株能够通过积累渗透调节物质来抵抗盐胁迫[19]。梁晓艳等[20]研究发现，在盐胁迫环境下，耐盐植物品种叶片中较高的脯氨酸含量是其重要的耐盐适应特征。在本研究中同样发现，耐盐棉花品种(品系)植株叶片中的脯氨酸含量显著高于盐敏感棉花品种，表明在盐胁迫下耐盐棉花中脯氨酸的积累有利于其维持较高的抗性。在本研究中还发现，耐盐棉花品种(品系)与盐敏感棉花品种间的渗透调节物质差异存在不一致，其中盐敏感棉花品种新陆早74叶片中的可溶性蛋白含量、可溶性糖含量显著高于耐盐棉花品种中H177，盐敏感棉花品种中J0102叶片中的可溶性蛋白含量、可溶性糖含量则显著低于耐盐棉花品种(品系)，可能是由于2种盐敏感棉花品种对盐的耐受性不同[21]。由于盐胁迫造成植株中Na+过量，使得活性氧产生和积累，造成了氧化胁迫，从而加剧了膜脂过氧化产物丙二醛的积累[22]。在本研究中，耐盐棉花品种(品系)的膜脂过氧化产物丙二醛含量显著低于盐敏感品种，植株在应激环境下，能够通过SOD、POD和CAT活性的变化来提高自身的抗氧化水平以清除活性氧[23]。本试验通过对不同棉花品种(品系)叶片中SOD活性、POD活性和CAT活性的研究发现，盐敏感棉花品种与耐盐棉花品种(品系)的抗氧化酶活性具有不同的变化趋势：耐盐棉花品种(品系)的SOD活性较高但POD活性不高，可能由于叶片中的SOD活性增大，导致超氧阴离子自由基(O2·-)更多地转化为H2O2，从而抑制了POD活性；耐盐棉花品种(品系)叶片中的CAT活性则显著低于盐敏感棉花品种，说明氧化应激方式在耐盐棉花类型和种间存在差异[24]，也进一步说明耐盐棉花品种(品系)和盐敏感棉花品种抵抗盐胁迫的方式存在差异。

3.2 不同耐盐棉花品种(品系)光合效率的差异

本研究发现，盐胁迫条件下盐敏感棉花品种的光合参数(Pn、Gs、Ci和Tr)显著低于耐盐棉花品种(品系)，并且盐胁迫会导致植株光合作用减弱[25]。对光合作用的影响主要体现在2个方面：气孔因素和非气孔因素[26]。气孔限制会导致Ci降低，进而降低净光合速率，而非气孔限制一般会引起Ci升高[27]。在本研究中，盐敏感棉花品种的Pn、Gs和Ci变化一致，说明盐敏感棉花品种的光合速率主要受气孔因素的影响。郭丽丽等[28]研究发现，在盐胁迫下光合速率的下降受到气孔和非气孔因素影响，本研究中耐盐棉花品种(品系)间Pn、Gs和Ci的变化并不一致。通过对非气孔因素的研究发现，耐盐棉花品种(品系)叶片中的叶绿素含量显著高于盐敏感棉花品种，并且叶绿素含量在耐盐棉花品种(品系)间也存在显著差异，说明耐盐棉花品种(品系)通过提高自身的光合作用来降低盐胁迫的损害，并且Pn的变化可能同时受到气孔因素和非气孔因素影响。

3.3 不同耐盐棉花品种(品系)对离子平衡响应的差异

盐胁迫下大量Na+的流入及K+的排出会产生离子毒害，而植株抵御离子毒害的重要途径是通过抑制Na+向地上部分运输并且减缓叶片中K+的流失[29-30]。在本研究中，耐盐棉花品种中H177地下部分较其他棉花品种(品系)保持了较高的Na+含量，并且根系中的Na+含量高于地上部分，表明其根部保留了大量Na+，减少了Na+向地上部分的运输，从而减轻了对幼苗的毒害。相关研究发现，组织中高K+/Na+是棉花耐盐能力的一个重要鉴定指标[31]。在本研究中，耐盐棉花品系中J0710叶、根中Na+、K+含量均显著低于盐敏感棉花品种新陆早74，但其地上部分的K+/Na+较盐敏感棉花品种新陆早74高，这可能是由于植株能够采取更有效的机制参与K+、Na+的转运，而不是依赖于对K+、Na+的吸收能力[32-33]。在本研究中，耐盐棉花品种(品系)和盐敏感棉花品种各器官的K+含量和K+/Na+表现出明显差异，总体表现为耐盐棉花品种(品系)高于盐敏感棉花品种，也表明耐盐棉花品种(品系)能够通过保持低Na+、高K+来维持自身的离子稳态。

3.4 棉花苗期的耐盐性评价

盐胁迫对棉花的影响表现在渗透调节、抗氧化酶活性、光合作用及离子平衡等方面[34]，为了全面准确地评价不同棉花品种(品系)的耐盐性，应当通过与耐盐性相关的多项指标进行综合评价。在本研究中，通过对4个不同耐盐性棉花品种(品系)的21个相关指标的鉴定评价发现，光合参数、SPAD值和CAT活性、POD活性在其耐盐性评价中的权重系数较高，表明这些指标能反映棉花的耐盐性，因此可以通过施加外源添加物等方法提高棉花的光合效率、抗氧化酶活性等增强棉花的耐盐性[35-36]。通过主成分分析法和灰色关联度分析法进行的棉花耐盐性综合评价，使得不同棉花品种(品系)的耐盐性评价更加客观合理，也为今后在实际生产中评价棉花的耐盐性提供了较为方便的方法。

4 结 论

在盐胁迫环境下，棉花通过合成较多叶绿素来维持其叶片的光合能力，同时通过维持高K+/Na+、较低的丙二醛含量来提高自身的耐盐性。与盐敏感棉花相比，耐盐棉花始终保持较高的光合能力和K+/Na+。通过主成分分析法和灰色关联度分析法进行综合评价发现，耐盐性评价指标中的光合指标、SPAD值和抗氧化酶活性可作为重要的鉴定指标，并且鉴定结果表明，供试的棉花品种(品系)中，中H177在苗期的耐盐性较好。