氧化苦参碱对糖尿病肺损伤的保护作用

曾 晓，谢志斌

（武汉科技大学附属孝感医院呼吸内科，孝感 432000）

2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是常见的慢性病之一，其特征是长期代谢紊乱并胰岛素相对缺乏［1］。T2DM被认为是一种引起微血管并发症的慢性疾病，常导致严重疾病和过早死亡［2］。众所周知，引起T2DM的机制为：胰岛素抵抗和胰岛素分泌减少。新近流行病学发现，实验和临床证据提示炎症介质和凋亡介质参与T2DM发病机制［3-5］。新近研究发现，慢性糖尿病可能诱发肺功能障碍［6］。这引起了人们对“糖尿病肺”的广泛关注。

氧化苦参碱（Oxymatrine，OMT）是苦参的主要活性成分，常用于如炎症，抗纤维化等多种疾病的治疗。已被用于治疗炎症性疾病，心肌缺血引起的心脏损伤［7］，高血压［8］。先前研究表明它对缺血和再灌注损伤具有保护作用［9］。其机制可能与抑制氧化应激，炎症和诱导细胞凋亡有关。然而，迄今为止尚未有关于OMT对糖尿病大鼠肺损伤保护作用的研究报道。本研究旨在探讨OMT对糖尿病大鼠肺损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养正常人肺上皮细胞BEAS-2B购自美国模式培养物集存库（American type culture collection）。培养BEAS-2B细胞在Dulbecco改良Eagle培养基中补充用10%胎牛血清（Gibco）在37℃，5%CO2中。

1.2 动物模型Sprague-Dawley（SD）大鼠15只（平均重量200g），购自湖南省斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于湖南省中医药研究院实验动物中心。所有SD大鼠随机分组分为三组：正常组，糖尿病组（DB）和氧化苦参碱（DB + OMT）处理组。SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ；65 mg/kg）诱导糖尿病。然后，正常组给予正常饲料。DB组和DB+OMT组给予高脂饮食三个月。给予OMT（0.5mg/kg）到DB+OMT组三个月。所有动物测试程序经中南大学动物实验中心伦理委员会批准。

1.3 细胞活力测定采用3 -2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）法检测细胞活力。将BEAS-2B细胞接种到96孔板中，每孔1×103个细胞，然后0，25，50，75和100μg/mL OMT持续孵育12，24，48，72小时，分别。通过酶标仪记录490nm处的吸光度。

1.4 细胞凋亡检测采用膜联蛋白-V/PI测定BEAS-2B细胞凋亡。根据制造商说明书提供的方法，采用流式细胞术检测细胞凋亡。

1.5 苏木精和伊红染色和免疫组织化学肺组织采用多聚甲醛灌注（40g/L），之后固定在40 g/L中性缓冲福尔马林中，酒精脱水，石蜡包埋，HE和免疫组化染色组织切片。组织切片在蛋白质阻断剂中孵育30min，4℃单克隆小鼠抗EGFR和NapsinA抗体孵育过夜，生物素化兔抗大鼠免疫球蛋白G作二抗。显微镜观察EGFR和Napsin A在肺组织中的表达情况。

1.6 实时聚合酶链反应分析qRT-PCR检测TGF-β1，IL-1，IL-6，IL-12 mRNA的相对丰度。采用Primers软件设计合成PCR引物。在20μL反应体积中一式两份进行 2×SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems），每种引物500nM，和2μLcDNA。放大条件设定为：54℃2min，94℃10min，36个循环在94℃变性20sec，60℃延长6min。相对表达采用Ct方法计算TGF-β1，IL-1，IL-6，IL-12的表达水平（Applied Biosystems）。所有数值均归一化为GADPH基因的表达。

1.7 联免疫吸附剂分析测定酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测SD大鼠血浆TGF-β1，IL-1，IL-6，IL-12含量。细胞因子从标准曲线计算浓度。

1.8 蛋白质印迹分析采用SDS-PAGE分离来自每组提取的蛋白质，并转移至PVDF膜。随后用脱脂牛奶将膜封闭，一抗置于4℃冰箱孵育过夜（PI3K，Akt，p-Akt，P38MAPK，jin，ERK一抗孵育（BD Systems；1：400稀释）。室温摇床孵育二抗（Cell Signaling Technology，1：10，000，用碧云天一抗稀释液稀释），β-actin作为内参。免疫检测的蛋白质条带是使用Image J进行量化并通过统计分析方差分析软件。

1.9 统计分析所有统计分析均采用SPSS 21.0进行。数据以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析和t检验进行。P＜0.05为 差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 氧化苦参碱对正常肺上皮细胞增殖与凋亡的影响为了检测氧化苦参碱对BEAS-2B损伤的影响，本研究检测细胞活力和细胞凋亡情况。MTT结果显示，氧化苦参碱对BEAS-2B细胞株活力没有影响（图1A）。氧化苦参碱（75和100μg/ mL）可以诱导细胞凋亡（图1B）。

图1 氧化苦参碱对BEAS-2B人肺上皮细胞的增殖和凋亡的影响A.MTT法测定12，24，48，72小时不同浓度氧化苦参碱处理BEAS-2B人肺上皮细胞的增殖；B.流式细胞术测定12，24，48，72小时不同浓度氧化苦参碱处理BEAS-2B人肺上皮细胞的凋亡。与对照组相比，*P＜0.05时被认为有统计学显著差异。

2.2 评估糖尿病大鼠体重、血糖和脂质本研究检测各组动物体重，血糖，甘油三酯和甘油三酯的变化情况。结果显示，与对照组比较，糖尿病动物体重，血糖，甘油三酯和总胆固醇水平显著升高，氧化苦参碱治疗显著降低糖尿病前述相关指标（图2）。

图2 氧化苦参碱对糖尿病大鼠血糖（Glu），甘油三酯（TC）和总胆固醇（TG）的影响。A. 氧化苦参碱处理的糖尿病大鼠的体重显著降低。B-D.氧化苦参碱显著降低糖尿病大鼠血糖水平，TC和TG的浓度。与对照组相比，*P＜0.05时被认为具有统计学显著差异。

2.3 HE染色和免疫组化分析为了观察糖尿病对肺组织的损伤情况，本研究采用HE和免疫组化法染色观察各组动物肺组织的损伤情况。HE和免疫组化结果显示糖尿病引起肺组织EGFR和EGFR的表达明显；氧化苦参碱抑制糖尿病肺组织炎症反应；与模型组比较，氧化苦参碱组抑制EGFR，NanpsinA的表达水平（图3）。

2.4 氧化苦参碱对炎症因子TGF-β1，IL-1，IL-6，IL-12的影响高血糖可引发机体发生免疫炎症。因此，本研究采用ELISA和qRT-PCR检测各组血浆和肺组织中炎症因子的表达水平。结果显示，高血糖能引起糖尿病大鼠肺组织TGF-β1，IL-1，IL-6，IL-12水平和表达显著增加。氧化苦参碱抑制糖尿病肺组织损伤炎症指标水平的升高（图4和5）。这些结果提示氧化苦参碱可以抑制高血糖引起的炎症反应。

2.5 氧化苦参碱抑制糖尿病大鼠PI3K和MAPK的激活文献报道PI3K和MAPK信号通路参与调节机体氧化代谢。为了探讨氧化苦参碱对糖尿病大鼠的保护作用是否涉及调节PI3K，Akt，p-Akt，P38MAPK，jin，ERK蛋白的表达（图6）。本研究采用Western blotting检测PI3K，Akt，p-Akt，P38MAPK，jin，ERK蛋白的表达情况。结果显示，糖尿病大鼠肺组织PI3K，Akt，p-Akt，P38MAPK，jin，ERK蛋白的表达显著上调，氧化苦参碱处理显著降低前述蛋白的表达，提示氧化苦参碱通过下调前述蛋白的表达减轻糖尿病大鼠肺损伤。

3 讨论

图5 氧化苦参碱对糖尿病大鼠肺组织TGF-β1，IL-1，IL-6，IL-12 mRNA表达的影响。与正常组或DB组相比，氧化苦参碱降低TGF-β1，IL-1，IL-6，IL-12 mRNA（n=3）。与对照组比较，*P＜0.05具有统计学意义。

图6氧化苦参碱对糖尿病大鼠肺组织PI3K和MA显著增加，氧化苦参碱组PI3K，Akt，p-Akt蛋白水平更高。 B. DB组P38MAPK，jin，ERK蛋白的水平显著上调，并且在氧化苦参碱组显著上调。与对照组比较，*P＜0.05，被认为具有统计学差异。

目前人们对糖尿病并发症的研究主要集中于对心、肾、视网膜病变机制的研究，而对肺脏的研究相对较少，尤其是对糖尿病慢性肺损伤更为罕见。我们课题组前期研究发现糖尿病心肌I/R后肺容易受到损伤。本研究发现糖尿病慢性肺损伤与炎症有关，OMT可以抑制肺组织炎症相关的蛋白表达，从而改善糖尿病慢性肺损伤。

目前，氧化苦参碱在我国是一种用于治疗多种疾病的传统药物。众所周知，氧化苦参碱在调节机体机能活动或疾病方面具有多种药理作用，包括抗炎，心血管作用，抗纤维化，抗增殖等作用［7-9］。氧化苦参碱还通过促进胰岛素分泌介导抗糖尿病作用，增强葡萄糖摄取，抑制肠道吸收葡萄糖，减少糖原分解。然而，较少有文献报道氧化苦参碱对2型糖尿病的直接作用。本研究为了诱导炎症反应，通过诱导糖尿病大鼠高血糖引起肺组织损伤，从而导致一系列病变。进一步结果显示氧化苦参碱可以预防由高血糖引起的组织损伤。本研究发现氧化苦参碱可以抑制氧化苦参碱细胞因子TGF-β1，IL-1，IL-6，IL-12表达，减少炎症细胞或，糖尿病大鼠肺组织Napsin A和EGFR表达。

氧化苦参碱通过阻断VEGFR-2受体介导的PI3K /Akt / mTOR信号通路，抑制多种肿瘤细胞的生长，从而阻止血管生成并促进肿瘤细胞凋亡［10-12］。另有研究显示DATS通过激活PI3K/Akt/Nrf2信号途径减轻高血糖诱导的ROS介导的细胞凋亡，进一步增强暴露于高血糖的心肌细胞中Nrf2介导的抗氧化酶［13］。此外，氧化苦参碱增强细胞活力，增殖能力和葡萄糖诱导的胰岛素分泌。其可能机制是氧化苦参碱激活p38 MAPK和磷酸化ERK拮抗波动性高血糖。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联，包括JNK，ERK和p38MAPK在哺乳动物细胞中介导许多重要信号，如细胞增殖，分化，凋亡。本研究发现，氧化苦参碱通过促进PI3K和MAPK信号通路来拮抗高血糖引起的病理反应调节肺组织细胞存活。本研究表明氧化苦参碱可用作治疗糖尿病并发症的候选药物，其分子调节机制值得进一步探讨。