HPLC法测定黄连中3种原小檗碱型生物碱的研究

刘 娜， 管淑玉， 徐 鹏， 杨然存， 于阿娟

（1.河南省产品质量监督检验院，郑州 450001； 2.国家建筑装修材料质量监督检验中心，郑州 450001；3.郑州大学化学学院，郑州 450002）

黄连（Rhizoma coptidis）是一种重要常用的中草药. 传统中医理论认为黄连具有清热解毒，泻火燥湿等功效［1］. 现代药理学研究显示，黄连中小檗碱、巴马汀、药根碱等原小檗碱型生物碱作为主要活性成分具有消炎、抗菌、镇痛、降血压等作用［2］. 以黄连为原料的中成药品中有黄连上清片、复方黄连素片、加味香连丸等上百种，在临床上得到了广泛的应用，并有新型复方制剂不断研制出来.

中国药典（2015版）一部中，黄连的含量测定采用液相色谱法对盐酸小檗碱、巴马汀等进行测定［3］. 众所周知，中药药效是药材中多种活性成分共同作用的结果，因此建立同时测定黄连药材中多种活性成分的便捷、快速、准确的分析方法，对药材及制剂的质量控制有重要的意义.

近来文献报道测定该类物质的方法中［4-20］，高效液相色谱法（HPLC）以其方便、快速、高专属性，相对于液质等串联技术成本低廉而被广泛采用. 然而多数报道反映出各生物碱色谱峰拖尾严重，尤其是药根碱等与相关物质色谱峰严重重叠、不能有效同时分离多种生物碱等问题. 一些研究认为在流动相中添加离子对试剂可以减小色谱峰拖尾、增加各生物碱之间的分离度. 然而在实际应用中发现，伴随着离子对试剂的使用，常常出现基线噪音大、平衡时间过长、色谱柱使用寿命变短等不利因素. 因此，本文拟建立一种非离子对环境下，快速、灵敏、高选择性的反相高效液相色谱法同时测定黄连中的小檗碱、巴马汀、药根碱，为黄连及其制剂的质量评价提供依据.

1 实验部分

1.1 仪器和材料

Waters 2695 HPLC 系统，包括2996 DAD 检测器、Empower 2 工作站（美国Waters 公司）；Agilent Zorbax C18（250 mm×4.6 mm；5 μm；Agilent）色谱柱.

甲醇、乙腈为色谱纯（Merck，德国），其他试剂均为分析纯，实验用超纯水由Milli-Q超纯水系统（Millipore，美国）制备. 盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱标准品购自中国药品生物制品检定所. 黄连（味连）药材购自郑州药材市场.

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 Agilent Zorbax C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent）色谱柱. 流动相A：乙腈；流动相B：0.02 mL/mol 磷酸二氢钾溶液（含0.2%三乙胺，H3PO4调pH 值3.0）；梯度洗脱程序：0～40 min V（A）%：15%～38%，40～50 min V（A）∶V（B）=38∶62；流速1 mL/min. 检测波长265 nm；柱温：25 ℃；进样量5 μL.

1.2.2 标准贮备液配制 准确称取盐酸小檗碱9.0 mg、盐酸巴马汀3.1 mg、盐酸药根碱1.0 mg于50 mL容量瓶中用甲醇溶解并定容. 即为盐酸小檗碱浓度为180 μg/mL、盐酸巴马汀62 μg/mL、盐酸药根碱20 μg/mL的标准贮备液，放置于-4 ℃的冰箱中备用.

1.2.3 样品制备 黄连药材粉碎后过3号筛，准确称取药材粉末0.025 g用盐酸-甲醇（1∶100，V/V）溶液定容至25 mL，超声30 min，冷却后补足损失备用.

2 结果与讨论

2.1 提取方法

实验中分别采用常温水、热水（50 ℃）、不同浓度的甲醇-水及盐酸-甲醇（1∶100，V/V）溶液对样品进行超声提取. 发现100%甲醇对3 种生物碱的提取效果最佳，与盐酸-甲醇（1∶100，V/V）溶液基本相同（图1），但在后者色谱图中出现较多的未知峰，经与空白溶液图谱对比这些峰主要来自样品本身. 为了更好地反应样品本身的化学信息，实验选择后者为提取溶剂. 萃取溶液中添加适量的盐酸有助于使原小檗碱型生物碱以盐酸盐形式存在，从而更容易溶于提取溶剂. 经实验考察1%的盐酸足够盐酸盐的形成，过高的盐酸含量会腐蚀仪器管路. 在提取时间选择上，发现30 min 已将目标物提取充分，故提取时间选择30 min（图2）.

图1 不同溶剂对提取效果的影响Fig.1 Extraction efficiency of different extraction solvents

2.2 色谱条件选择

2.2.1 检测波长的选择 将3 种生物碱标准溶液分别在190～400 nm紫外波长下扫描，结果均在265、345 nm处有最大吸收，但345 nm波长下的色谱图基线较265 nm下平稳. 可能是由于一些含有机氮原子但分子结构较小或共轭链较短的化合物在265 nm附近有吸收，而在345 nm附近无吸收. 故将波长设在265 nm处，既可对目标物进行准确定量又可兼顾相关物质的有效检出，能更好地反映出样品中的化学信息，故选择265 nm作为检测波长（图3）.

图2 不同提取时间的提取效果Fig.2 Extraction efficiencies of different extraction times

图3 黄连的样品色谱图Fig.3 Typical chromatograms of Rhizoma coptidis

2.2.2 流动相的选择 曾先后探索了等度系统：甲醇-水、乙腈-水、乙腈-三乙胺-磷酸-水溶液、甲醇-三乙胺-醋酸-水溶液、甲醇-磷酸二氢钾-三乙胺-磷酸-水溶液、乙腈-磷酸二氢钾-三乙胺-磷酸-水溶液、乙腈-甲醇-磷酸二氢钾-三乙胺-磷酸-水溶液、乙腈-甲醇-磷酸二氢钾-十二烷基磺酸钠-三乙胺-磷酸-水等流动相体系；梯度系统：乙腈-甲醇-磷酸二氢钾-三乙胺-磷酸-水溶液、乙腈-磷酸二氢钾-三乙胺-磷酸-水溶液、乙腈-磷酸二氢钾-十二烷基磺酸钠-三乙胺-磷酸-水等流动相体系. 实验发现在上述流动相条件下巴马汀与小檗碱在多数情况下分离情况比较满意，然而药根碱与相邻峰的重叠比较严重甚至完全重叠. 只有乙腈-磷酸二氢钾-三乙胺-磷酸-水溶液梯度系统获得最佳分离效果. 另外，三乙胺作为改性剂可以抑制不良硅羟基效应改善峰形. 经考察流动相中含0.2%的三乙胺已经足够掩蔽解离的硅羟基，继续增大其浓度除化合物保留值减小外，对分离无显著改善.

2.2.3 色谱柱的选择 分别考察了Elite Hypersil BDS C18 column（5 μm，200 mm×4.6 mm），Dikma Diamonsil ODS C18 column（5 μm，150 mm×4.6 mm），Dikma Diamonsil ODS C18 column（5 μm，200 mm×4.6 mm），Water Symmetry C18 column（5 μm，150 mm×4.6 mm），Agilent Zorbax SB C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）等色谱柱. 在选择的流动相条件下3种生物碱在Zorbax SB C18上获得了最佳的分离. Zorbax SB C18采用的是弱酸性的硅胶（B型硅胶），一般对离子或可电离化合物，尤其是碱性化合物分离较好. 故采用Zorbax SB C18色谱柱进行色谱分析.

2.2.4 pH值的选择 较低的pH值可以抑制固定相上硅羟基的解离，但过高或过低的pH值都均对固定相不利，尤其是在较高温度下会造成固定相的流失. 实验分别考察了pH 2.5、2.8、2.9、3.0条件下的分离状况. 在pH值2.5～3.0范围内，分离状况无较大差异. 故选择pH 3.0.

2.2.5 柱温的选择 由于离子型样品对温度变化很敏感. 故实验中应保持柱温恒定. 实验分别考察了20、25、30、35、40 ℃条件下各生物碱的分离情况. 发现温度对药根碱与相邻物质色谱峰的分离很关键，高于或低于25 ℃时均会增加其与相邻峰的重叠. 故选择实验应恒温在25 ℃.

2.3 标准曲线线性范围和检出限

将1.2.2节的标准贮备液适当稀释成不同浓度的标准溶液，按标准曲线步骤进行实验. 结果见表1.

表1 标准曲线线性范围和检出限Tab.1 Linearity of standard curve and limit of detection

2.4 方法精密度

同一天内对同一标准溶液连续进样六次，以峰面积的相对标准偏差考察精密度，相对标准偏差分别为药根碱0.73%、巴马汀0.57%、小檗碱0.53%.

2.5 加标回收实验

分别称取9 份平行样品，加入3 种不同浓度水平的标准溶液，进行加标回收实验（n=3），平均回收率在92.9%～105.9%之间，结果见表2.

表2 样品加标回收实验Tab.2 Results of sample spiked recovery tests（n=3）

2.6 样品测定

在选定的色谱条件下，取对照品溶液及样品溶液5 μL 进样，测定峰面积值，按外标法定量. 不同批次黄连药材中生物碱的含量测定结果见表3.

表3 样品测定结果Tab.3 Contents of alkaloids in samples（n=3） 单位：mg·g-1

3 结论

原小檗碱型生物碱是季铵碱，具有较强的碱性，在普通流动相中主要以阳离子形式存在，易与固定相上解离的硅羟基牢固结合造成色谱峰拖尾. 另外黄连中的非洲防己胺和药根碱是位置异构体，表小檗碱和这对异构体分子量只相差2，更加造成了对该类生物碱进行分离分析的难度.

本实验对色谱柱、流动相、pH、柱温等色谱条件进行了考察优化. 采用非离子对环境下的反相高效液相色谱法对9 个批次黄连样品中的3 种生物碱进行测定，结果表明：①在流动相中不添加离子对试剂的情况下，黄连中的多种生物碱完全可以实现良好的分离. ②当前市售黄连药材中各生物碱的含量变化范围很大，因此市售黄连药材质量的稳定性需要加强控制.