底物浓度对光合产氢过程动力学的影响

荆艳艳， 李 芳， 王 毅， 王鹏飞， 董丛丛

（河南农业大学机电工程学院，郑州 450002）

能源短缺、资源枯竭、环境恶化促使人类重视可再生能源的开发和利用［1］，氢能因其无污染、能耗低、操作简单等优点［2］，被认为是最有前景的能源之一［3］. 光合生物制氢的研究主要集中在制氢材料、制氢工艺和菌种筛选等方面［4-6］. 在光合产氢过程中，光合细菌生长、基质消耗和氢气生成同其他细菌一样受多种因素的影响. 南京工业大学焦敏等采用改进的自适应遗传算法研究了丙酮丁醇间歇发酵过程动力学模型［7］；Taro等对生物质热解过程动力学进行了研究［8］，确定了生物质热解的途径；王通洲和高虹利用一级动力学模型和分布活化能模型［9］，比较了两种玉米秸秆热解的过程动力学；山东理工大学崔洪友等考察了温度和CO2压力对水热条件下CO2催化棉纤维水解制糖过程动力学特性的影响［10］；李道义等建立发酵动力学模型对牛粪批次和连续高温干式厌氧发酵实际运行进行了动态模拟［11］；杨艳霞等采用格子Boltzmann方法模拟了有机废水溶液绕流附着有光合生物膜管束的流动、传质及光合生物反应等过程［12］，得出交叉排管有利于传质及生物降解；廖强等建立了光合细菌比生长速率、基质比消耗速率和比产氢速率关于底物初始浓度影响的数学模型［13］；河南农业大学张全国等研究了酸碱度对玉米秸秆酶解液光合生物产氢动力学的影响，解释了混合菌群的产氢动力学特性［14-15］；此外还有部分研究者在蛋白质、环境和食品微生物等领域［16-18］做了动力学方面的一些开拓性的工作.

研究不同产氢条件对光合细菌生长、底物消耗和产物生成等方面的动力学影响及相关数学模型具有重要指导意义. 实验利用课题组从污泥废水中富集得到的光合菌群［19］，研究光合产氢过程光合细菌新陈代谢、底物降解和氢气生成的相关关系，为实现生物制氢效率的提高及工业化制氢奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用光合产氢菌种是由深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）、荚膜红假单胞菌（Rhodopseudomonas capsulata）、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas pulastris）、类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）和荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）组成的混合菌种［19］. 混合菌种的产氢培养基为：NH4Cl 0.4 g/L，MgCl20.2 g/L，酵母膏0.1 g/L，K2HPO40.5 g/L，NaCl 2 g/L，谷氨酸钠3.5 g/L，并调节培养基pH值至中性.

1.2 实验方法

在250 mL反应瓶中按照体积比1∶4接入处于对数生长期的光合产氢混合菌种和产氢培养基，反应瓶有效容积为200 mL，即光合产氢混合菌种40 mL，产氢培养基160 mL. 然后分别加入葡萄糖浓度5、10、20 mg/mL三个水平的产氢底物（即葡萄糖加入量分别是1、2、4 g），然后调节反应液pH值至7.0后，将产氢反应器密封并置于MGC-250智能光照培养箱内进行产氢实验. 培养箱内光照强度3000 lx，温度30 ℃.

1.3 测试方法

1.3.1 细胞干重 每12 h取光合产氢菌液样品置于6000 r/min高速离心机离心，然后倒掉上清液，并在65 ℃下烘干至恒重，称量获得混合菌种细胞干重.

1.3.2 底物浓度 每24 h取样，采用3，5-二硝基水杨酸比色法，利用分光光度计测定样品在540 nm波长处的光密度值，对照葡萄糖浓度标准曲线计算待测样品底物浓度.

1.3.3 产氢量 采用排水集气法和气相色谱测量产氢量.

1.4 动力学模型

1.4.1 底物降解消耗模型 葡萄糖作为最常见的六碳单糖，广泛存在于淀粉、纤维素、半纤维素等多糖中，是光合产氢主要原料之一. 研究探索葡萄糖作为产氢底物的消耗规律，有利于提高生物质秸秆、糖蜜废水、淀粉废水等富含纤维素和淀粉类物质的产氢能力. 底物葡萄糖浓度随时间变化曲线为反S曲线，本文采用修正后的Logistic模型描述光合细菌产氢底物降解曲线，修正后的Logistic方程为：

式中：k为葡萄糖降解速率因子；Amax为葡萄糖最大消耗量，mg/mL；λ降解葡萄糖的降解延迟期，h；Mt为t时刻葡萄糖质量浓度，mg/mL；M0为葡萄糖初始质量浓度，mg/mL.

1.4.2 产氢模型 采用改进的Gompertz方程［15］，使之适用于发酵产氢动力学参数的拟合：

通过对上式微分可得到用于描述产氢气速率的动力学方程为：

2 结果与分析

2.1 光合产氢底物消耗规律

混合菌种光合产氢底物消耗规律及拟合曲线如图1所示. 各浓度条件下，随着光合细菌产氢代谢的进行，葡萄糖逐渐被分解利用，一部分用于提供光合细菌自身代谢活动的能量，一部分转化为氢气对外释放，在整个产氢过程中葡萄糖的浓度不断减小. 底物浓度5、10 mg/mL的反应在120 h时葡萄糖浓度已经相对较低，分别为0.379 3、0.949 4 mg/mL，而底物浓度为20 mg/mL的反应在120 h时葡萄糖浓度仍达10.852 7 mg/mL，说明底物浓度是光合产氢的重要影响因素，混合菌种光合产氢分解利用葡萄糖合理的底物浓度为10 mg/mL.

利用修正的Logistic 模型对底物消耗进行拟合得到的参数值见表1，底物浓度5、10、20 mg/mL，相关系数分别为0.998 8、0.997 2和0.982 7，均大于98%，说明修正的Logistic 方程适用于混合细菌光合产氢过程葡萄糖的消耗规律. 底物浓度20 mg/mL，葡萄糖最大消耗量为17.014 6 mg/mL，剩余未被利用的葡萄糖量较多. 5、10 mg/mL 的产氢系统，葡萄糖降解利用程度较高，底物浓度接近零. 20 mg/mL的系统，葡萄糖的降解延迟期最长为100 h，其次是10 mg/mL，而5 mg/mL的降解延迟期最短为55 h. 表1和图1同时说明，光合产氢底物浓度过大，不利于底物的转化利用，而且降解延迟期较长，因此底物浓度10 mg/mL较为合理.

图1 光合产氢过程底物消耗动态曲线Fig.1 The substrate consumption dynamic curve

表1 光合细菌底物消耗动力学参数估计Tab.1 The parameter estimates of substrate consumption dynamic

2.2 混合菌种光合产氢

不同底物浓度对光合细菌产氢的影响如图2所示.光合细菌在24 h以后开始产氢，72 h内的产氢量较低，随后产氢量增长迅速，168 h后产氢量基本稳定，且在实验设置范围内，20 mg/mL的产氢量最大为551 mL，其次是10 mg/mL，而底物浓度为5 mg/mL 的产氢量最低仅230 mL. 从Gompertz模型所拟合的产氢曲线可以看出实验数据和拟合值相差较小，Gompertz模型能较好地描述光合细菌产氢的过程.

表2给出了Gompertz模型拟合方程各项参数，底物浓度20、10、5 mg/mL 的Gompertz 模型拟合最大累积产氢量分别是588、409、233 mL，与实验测试数据误差分别为6.715 1%、7.631 6%、0.869 6%. 根据Gompertz 模型计算获得的最大产氢速率分别是6.637 9、4.168 7、4.102 7 mL/h，最大累积产氢量和最大产氢速率的变化趋势一致，都是底物浓度20 mg/mL 的产氢系统最大.各浓度条件下，产氢延迟期的时间都在65～75 h之间，且相关系数R2均大于99%，说明Gompertz 模型对光合产氢过程拟合的非常好.

图2 底物浓度对混合菌种产氢量的影响Fig.2 The influence of substrate concentration on hydrogen production

表2 产氢能力的Gompertz模型拟合参数Tab.2 The parameter of Gompertz model on hydrogen production

利用Gompertz模型拟合各参数获得产氢速率的动力学方程，绘制的产氢速率变化曲线如图3所示. 各底物浓度下，产氢速率都呈先增大后减小的趋势，80 h以前底物浓度5 mg/mL的系统产氢速率最小，底物浓度10、20 mg/mL的系统产氢速率大于5 mg/mL的系统且两者差别不大. 80 h后，20 mg/mL系统的产氢速率继续快速增高并于107 h达到最大，而底物浓度5 mg/mL和10 mg/mL的系统分别在95 h和101 h达到最高，且底物浓度20 mg/mL 系统的最大产氢速率最高，即底物浓度较低，光合细菌对底物的消耗利用程度高，最大产氢速率出现的时间较早.

2.3 光合产氢动力学过程对比分析

光合细菌累积产氢量和光合细菌生长随时间变化规律符合S形曲线［20］，而光合细菌产氢代谢过程中底物消耗规律为反S 曲线. 底物浓度为10 mg/mL 的光合产氢系统，12～48 h 光合细菌已经进入对数生长期，生物量增长迅速. 随着生物量增加，系统内的整体代谢活动增强，底物葡萄糖浓度下降，且24～48 h葡萄糖浓度下降程度大于12～24 h. 反应12～48 h，光合细菌将葡萄糖底物从细胞外扩散到细胞内，同时在氢酶的作用下代谢生成氢气，但生物体内代谢活动转化的能量主要用于光合细菌自身的生长代谢作用，导致产氢体系已经有氢气的生成，但数量较少. 葡萄糖消耗量主要集中在48～120 h，此时底物浓度降低程度最大，且光合细菌产氢速率较高，系统氢气的生成主要在此时段，即光合细菌对数生长期和稳定期是底物消耗和氢气生成的主要阶段. 120 h以后光合细菌生物量开始减少，底物葡萄糖大部分已经被消耗分解，产氢速率下降，累积产氢量增加缓慢（图4）.

图3 Gompertz模型拟合计算的产氢速率Fig.3 Hydrogen production rate of Gompertz model calculation

图4 发酵产氢动力学过程对比分析Fig.4 Analysis of hydrogen production process kinetics

3 结论

1）修正的Logistic 模型对底物消耗进行拟合的相关系数均大于98%. 底物浓度20 mg/mL 的产氢反应，最大底物消耗量较低为17.014 6 mg/mL，底物浓度为5、10 mg/mL 的系统，葡萄糖消耗利用程度较高. 而且5 mg/mL 的产氢系统底物降解延迟期最短，其次是10 mg/mL，底物浓度20 mg/mL 的底物降解延迟期最长为100 h. 即光合产氢过程，底物浓度过大，不利于基质的转化利用，10 mg/mL的底物浓度较为合理.

2）底物浓度为5、10、20 mg/mL 的产氢系统，模型拟合的产氢量与实验数据相差较小，相关系数均大于99%. 产氢延迟期都在65～75 h之间，且产氢速率分别在95、101、107 h达到最大，说明底物浓度低，光合细菌对底物的消耗利用程度高，最大产氢速率出现时间较早.

3）光合产氢过程，累积产氢量和细菌生长随时间变化规律符合S形曲线，而底物消耗规律为反S曲线.反应12～48 h，细菌生长迅速，底物浓度下降，此时生物体内代谢活动转化的能量主要用于光合细菌自身的生长代谢作用，产氢量较少；反应48～120 h，底物消耗程度增大，光合细菌产氢速率较高，即光合细菌对数生长期和稳定期前期是底物消耗和氢气生成的主要阶段.