辐照对抗草甘膦转基因大豆DNA的降解研究

杜 艳，陈复生，陈 晨

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

转基因作物是指通过基因改造生产的作物，又称基因改造生物(Genetically modified organisms)、基因工程作物(Genetically engineered crops)、生物技术植物(Biotech plants)等。1994年，Monsanto公司开发的抗草甘膦(Roundup Ready，RR)转基因大豆获FDA批准，成为较早大规模商业化的转基因作物之一[1]。目前，转基因作物已在全球得到大面积推广，据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2018年世界范围内转基因作物的种植面积达1.917亿hm2，是1996年的(170万hm2)113倍。其中转基因大豆的种植面积(9 590万hm2)最大，占所有转基因作物种植面积的50%左右，是世界上非转基因大豆种植面积的3.6倍[2]。

转基因作物具有改善农业生态环境、减轻病虫害、降低生产成本、提高农民收入等优势。1996—2016年的21年间，转基因作物总产量6.58亿t，累计为农民增收1 861亿美元，减少了2.71亿t的CO2排放量[3]。但由于转基因作物突破了物种之间的界限，引入非植物本体自然进化得到的基因，使得转基因食品的安全性始终存在很大争议[4-5]。

王卫国等[6]认为，食品加工过程中的物理、化学等处理方式可以有效减少甚至去除转基因产品中的外源基因，从而降低转基因产品的安全隐患。Tian等[7]研究表明，将RR大豆DNA置于90 ℃加热15 min，大豆内源lectin基因919 bp以上片段扩增结果呈阴性。绝对定量结果显示，随着加热时间的延长，RR大豆内源lectin和外源cp4epsps基因的拷贝数均发生下降[8]。经微波处理之后，RR大豆DNA可扩增的片段长度明显下降，内外源基因均发生严重降解[9]。

辐照技术是20世纪发展起来的一种食品处理技术。电子加速器或放射性同位素等释放出的高能射线，可以使蛋白质等物质的化学键发生断裂，降解生成小分子，从而达到杀菌、降低过敏原的致敏性、脱除毒素、降解农药残留等效果[10]。与此同时，辐照也可以直接作用于DNA或通过细胞中产生的自由基间接作用于DNA[11]，引起双链DNA的改性[12]或断裂[13]，造成动物[14]和植物[15]的DNA损伤，且随着辐照剂量的增加，DNA损伤程度逐渐加深[16]。

因此，本研究以RR大豆籽粒、大豆粉为对象，分别采用剂量为0、4、10 kGy的Co60γ-射线进行辐照，提取样品中的DNA，通过DNA的质量浓度，基因组DNA(gDNA)的完整性和分子量，以及外源基因片段长度和拷贝数的变化情况，监测辐照过程中RR大豆DNA的降解规律。为辐照在RR大豆外源基因降解方面的应用提供理论依据，进一步促进RR大豆的合理、健康利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

RR大豆：中国农业科学院；DNeasy Plant Mini Kit(目录号：69104)：德国Qiagen公司；琼脂糖M、4S Green Plus核酸染色剂：上海生工生物工程股份有限公司；10×Loading Buffer：北京Solarbio科技有限公司；2×PremixTaq：日本TaKaRa公司；λ DNA/Hind III Marker、Marker D2000 DNA：北京Tiangen生化科技有限公司；ddPCR Supermix for Probes、Droplet Generation Oil、Droplet Reader Oil：美国Bio-Rad公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA224S-CW型分析天平：德国Sartorius公司；Thermo Scientific Sorvall BIOFUGE Stratos全能台式高速离心机、Nanodrop 2000微量紫外-分光光度计：美国Thermo Fisher 公司；T100 Thermal Cycler PCR仪、UV light tray Gel Doc XR+凝胶成像系统、QX200微滴发生器、QX200微滴分析仪：美国Bio-Rad公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的辐照处理

分别称取20 g完整的RR大豆籽粒和20 g RR大豆粉(过60目筛)，包装于聚乙烯自封袋中，作为初始样品采用河南省科学院辐照工程技术中心的Co60γ-射线进行辐照，辐照剂量分别为0、4、10 kGy，每个剂量进行3次重复试验。

1.3.2 样品DNA提取及质量浓度和纯度检测

将辐照后的完整RR大豆籽粒粉碎，过60目筛。采用DNeasy Plant Mini Kit提取各粉状样品中的DNA[17]。用Nanodrop 2000微量紫外-分光光度计测定各DNA样品的质量浓度和纯度。

1.3.3 gDNA分子完整性检测

将0.6 g琼脂糖溶于60 mL 0.5×TBE缓冲液中制得质量浓度约为0.01 g/mL的琼脂糖凝胶。取9 μL DNA溶液与1 μL 10×Loading Buffer混合均匀后点样，于80 V恒压条件下电泳1 h。使用UV light tray Gel Doc XR+凝胶成像系统对DNA扩增结果进行拍照和观察[17]。

1.3.4 gDNA分子量分析

将经过不同剂量辐照的RR大豆和大豆粉的gDNA琼脂糖凝胶电泳图导入Gel-Pro Analyzer软件，根据目的条带与Marker的分子量比对结果，得出目的条带所对应的gDNA分子量。

1.3.5 内源lectin和外源cp4epsps基因的定性PCR检测

分别对内源lectin基因1 487 bp和外源cp4epsps基因1 512 bp进行扩增。定性PCR体系包含2×PremixTaq12.5 μL，上下游引物(表1)各0.4 μmol/L，模板DNA 50 ng，最后用无菌水补足体积至25 μL。定性PCR反应条件如下：95 ℃保持5 min；然后95 ℃保持30 s后，在54 ℃保持30 s，再在72 ℃保持90 s，循环35次；最后在72 ℃保持10 min。

1.3.6 辐照RR大豆粉外源cp4epsps基因的数字PCR检测

以不同剂量辐照后的RR大豆粉DNA为模板，对外源cp4epsps基因87 bp进行扩增。数字PCR体系包含2×ddPCR Supermix for Probes 10 μL，上下游引物(表2)各0.9 μmol/L，探针0.25 μmol/L，模板DNA 1 μL，最后用无菌水补足体积至20 μL。数字PCR反应体系如下：95 ℃保持10 min预变性；95 ℃保持30 s变性后，在60 ℃保持60 s进行退火和延伸，此过程循环40次；最后在98 ℃保持10 min。反应结束后，将样本放入QX200 Droplet微滴分析仪中，进行微滴分析检测和结果判读。

表2 cp4 epsps基因数字PCR的扩增引物和探针序列

1.3.7 数据统计与处理

采用SPSS 20.0软件进行方差分析，试验数值之间以Duncan法(P<0.05)进行差异显著性分析，采用Origin8.5软件对试验结果作图。

2 结果与分析

2.1 辐照对RR大豆、大豆粉中DNA质量浓度的影响

经不同剂量辐照后的RR大豆籽粒、大豆粉中DNA质量浓度和纯度如表3所示。由于DNA提取所用的样品质量均为0.1 g，此处的DNA的质量浓度可反映等量样品中DNA含量的高低。DNA的纯度主要取决于DNA溶液在260 nm和280 nm处吸光度的比值(A260/A280)以及在260 nm和230 nm处吸光度的比值(A260/A230)。DNA溶液的A260/A280值在1.8～2.0之间，表明DNA受蛋白质、RNA和酚类等物质的污染较小；DNA溶液的A260/A230值大于2.0，表明DNA受多糖、盐等小分子的污染较小[17]。

表3 不同剂量辐照的RR大豆、大豆粉DNA质量浓度和纯度

由表3可知，所有样品DNA的质量浓度在61～75 ng/μL之间，DNA溶液的A260/A280值为1.82～1.92，A260/A230值为3.52～9.13，均符合进一步检测的要求。此外，不论是大豆籽粒还是大豆粉，经过4～10 kGy的辐照后，样品DNA的质量浓度均发生下降，下降率为8.63%～17.03%。随着辐照剂量的增加，DNA质量浓度的下降率呈增加趋势。这与Maity等[20]的研究结果一致：Co60γ-射线辐照剂量从2 kGy增加至6 kGy过程中，水稻和鹰嘴豆的总DNA含量降低13%～33%，线性拟合结果表明样品总DNA的含量与辐照剂量呈负相关，R2在0.97～0.99之间。

2.2 辐照对样品gDNA完整性的影响

辐照前后样品gDNA的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

泳道M：λ DNA/Hind III Marker；泳道B：空白对照；泳道Z0、Z4、Z10分别表示RR大豆籽粒经0、4、10 kGy辐照之后的DNA电泳结果；泳道F0、F4、F10分别表示RR大豆粉经0、4、10 kGy辐照之后的DNA电泳结果。

gDNA条带的亮度与gDNA的总量成正比，条带亮度减弱表明DNA可能发生了断裂[20]。从图1可见，未经辐照的RR大豆籽粒、大豆粉中gDNA的条带亮度较强，gDNA完整性较高。随着辐照剂量增加，大豆籽粒、大豆粉gDNA的条带亮度均呈现下降趋势，泳道出现弥散现象，结合表3的DNA质量浓度变化规律，进一步验证了辐照后gDNA含量降低，DNA降解，完整性下降。这可能是由于辐照过程产生的高能射线会直接或通过超氧自由基(·O2-)等自由基的生成间接作用于DNA的化学键，诱导DNA不稳定性位点出现，诱导鸟嘌呤氧化，进而造成大分子DNA的断裂降解[11-13]。

2.3 辐照对样品gDNA分子量的影响

为了量化辐照过程中样品gDNA分子量的变化情况，将不同剂量辐照的RR大豆籽粒、大豆粉gDNA凝胶电泳图导入Gel-Pro Analyzer软件，输入λDNA/Hind III Marker对应的每一个条带分子量大小(从上到下依次为23 130、9 416、6 557、4 361、2 322、2 027、564 bp)，选中待测样品gDNA条带所在的泳道，即得各样品gDNA的分子量，分析结果如图2所示。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，图3同。

由图2可见，当辐照剂量为4、10 kGy时，辐照后的RR大豆籽粒和大豆粉gDNA分子量与未经辐照组相比明显降低。这表明，辐照后大豆gDNA的完整性呈下降趋势，基因发生降解，且随着辐照剂量的增加，降解程度加剧。辐照剂量与DNA降解程度之间的相关性在其他研究中也有报道[14]。Ryu等[16]采用DNA彗星实验表征辐照诱导的拟南芥DNA损伤反应，通过线性-二次剂量-响应模型显示：在0～48 Gy的低剂量辐照条件下，随着辐照剂量的增加，DNA损伤程度先显著增加，在6 Gy时达到饱和，后趋于稳定。Erel等[21]和Cetinkaya等[22]分别采用0～4 kGy和0.1～1.5 kGy的γ-射线处理鹌鹑肉和柑橘类水果，结果也显示样品DNA降解程度随辐照剂量的增加而加深。

辐照后RR大豆籽粒、大豆粉gDNA分子量下降率如图3所示。当辐照剂量相同时，大豆粉中gDNA分子量的下降率(8.85%～23.51%)明显高于大豆籽粒(6.64%～16.17%)。这表明，与完整的大豆籽粒相比，大豆粉中的DNA更容易受到辐照的影响而发生降解。这可能是由于完整的大豆籽粒在大豆皮的包裹下，细胞完整性高，而大豆粉在粉碎的过程中会伴随部分细胞的破裂，内容物流出，稳定性下降。

图3 不同剂量辐照的RR大豆籽粒、大豆粉gDNA分子量下降率

2.4 辐照对RR大豆粉外源cp4 epsps基因拷贝数的影响

微滴式数字PCR对RR大豆粉外源cp4epsps基因的扩增结果见图4，拷贝数分析结果见表4。

图4 不同剂量辐照的RR大豆粉外源cp4 epsps基因87 bp数字PCR扩增结果

由表4可知，随着辐照剂量的增加，RR大豆粉中外源cp4epsps基因的拷贝数呈下降的趋势，而当辐照剂量为10 kGy时，拷贝数仍在105左右。这与Villavicencio等[23]的结果类似：经0～1 kGy的γ-射线辐照，RR大豆外源cp4epsps基因195 bp扩增结果均呈阳性。这表明，10 kGy以下的辐照可以在一定程度上造成RR大豆外源基因的降解，拷贝数降低，但降解程度有限，不会对RR大豆的定性检测造成影响。

表4 不同剂量辐照的RR大豆粉外源cp4 epsps基因拷贝数

2.5 辐照对样品长片段内源lectin和外源cp4 epsps基因的影响

以不同剂量辐照后的RR大豆籽粒、大豆粉DNA为模板，分别对大豆内源lectin基因1 487 bp和外源cp4epsps基因1 512 bp进行扩增，电泳结果如图5、图6所示。

泳道M：Marker D2000 DNA；泳道B：空白对照；泳道Z0、Z4、Z10分别表示RR大豆籽粒经0、4、10 kGy辐照之后的DNA电泳结果；泳道F0、F4、F10分别表示RR大豆粉经0、4、10 kGy辐照之后的DNA电泳结果。(a)(b)(c)分别表示3次重复试验。

泳道M：Marker D2000 DNA；泳道B：空白对照；泳道Z0、Z4、Z10分别表示RR大豆籽粒经0、4、10 kGy辐照之后的DNA电泳结果；泳道F0、F4、F10分别表示RR大豆粉经0、4、10 kGy辐照之后的DNA电泳结果。(a)(b)(c)分别表示3次重复试验。

由图5、图6可知，所有样品的长片段lectin和cp4epsps基因均可以得到明亮、清晰的扩增结果。这进一步验证，尽管辐照会引起RR大豆DNA质量浓度和分子量的下降，可在一定程度上造成外源基因拷贝数的降低，但对其内外源基因长片段的降解效果并不明显。辐照不会影响RR大豆的定性检测，但若要达到大幅降解RR大豆外源基因的目的，仍需与其他处理方式共同作用。

3 结论

综上所述，Co60γ-射线辐照会造成RR大豆籽粒、大豆粉DNA质量浓度和完整性的降低，随着辐照剂量的增加，gDNA分子量下降率呈升高趋势。RR大豆粉中的DNA比完整大豆籽粒中的DNA更易于降解，辐照剂量越高，外源cp4epsps基因拷贝数越低。但是单独的辐照作用对内外源基因长片段的降解效果并不明显，在后续研究中可协同其他手段以加强外源基因的降解。