花期灌水对伦晚脐橙留树越冬果实枯水及品质的影响

姚京磊　宋放　王志静　蒋迎春　何利刚　王策　吴黎明

摘要 以三峡库区秭归较高海拔地区伦晚脐橙为材料，研究花期灌水对果实枯水和品质的影响，并从基因表达水平进行了分析。结果表明，花期灌水显著降低了伦晚脐橙的落果率和果实枯水指数，显著提高了果实可溶性固形物含量和出汁率，改善了果肉色泽，降低了果皮厚度;PCR分析结果表明，花期伦晚脐橙树经灌水处理后，其果实枯水相关基因PME、PG和Cx的表达量均显著上升，PAL、CAD、POD表达量则下降，表现出向减轻果实枯水现象发生的趋势。因此，花期灌水处理可以减轻伦晚脐橙果实枯水的发生，从而改善果实的品质。

关键词 伦晚脐橙;枯水现象;果实品质;基因表达

中图分类号 S 666文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）16-0052-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.014

Effects of Irriagition Treatment at Flowering Stage on Granulation and Fruit Quality in Lane Late Navel Orange

YAO Jing-lei1，2，SONG Fang2，WANG Zhi-jing2 et al （1.College of Horticulture and Gardening，Yangtze River University，Jingzhou，Hubei 434000;2.Institute of Fruit and Tea， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064）

Abstract Lane late navel orange in Zigui high altitude area of Three Gorgges Reservoir was used as materials to assess the effect of irriagition treatment at flowering stage on granulation index and fruit drop rate， and the expression profiles of granulation related genes were analyzed.As a result， irriagition treatment at flowering stage significantly decreased the granulation index and fruit drop rate， while the total soluble soild and juice yield were increased significantly， the flesh color was improved， and the peel thickness was reduced.In addition， semi-quantitative PCR revealed that the expression level of granulation related genes PME，PG and Cx，were induced under irriagition treatment，while genes of PAL，CAD and POD， were down-regulated under irriagition treatment accordingly appearing a trend of alleviation of granulation phenomenon.In summary，irriagition treatment at flowering stage can reduce the occurrence of granulation phenomenon and improve the fruit quality in lane late navel orange.

Key words Lane late navel orange;Granulation phenomenon;Fruit quality;Gene expression

基金項目 国家重点研发计划项目（2019YFD1001402）;湖北省柑橘产业技术体系;湖北省技术创新专项重大项目（2017ABA158）;湖北省农业科技创新中心资助项目（2016-620-000-001-030）。

作者简介 姚京磊（1995—），男，山东日照人，硕士研究生，研究方向：柑橘栽培生理及果实品质形成。*通信作者：吴黎明，副研究员，从事柑橘育种与栽培研究;王策，研究实习员，从事柑橘生物技术研究。

收稿日期 2020-02-24;修回日期 2020-03-24

伦晚脐橙是近年来湖北三峡库区栽培的一类晚熟柑橘品种，其果实品质优良，深受消费者的欢迎。由于其晚熟的特性，满足了国内柑橘春季鲜果销售的市场，具有较高的经济价值和社会价值。但伦晚脐橙自2011年规模化种植以来，出现了采前果实枯水现象。枯水的果实汁胞水分减少，颜色变浅，严重的变干、变瘪，品质严重下降。伦晚脐橙果实需要留树越冬栽培，受冬季低温和海拔的影响较大[1]。因此，通过栽培技术措施控制或减轻晚熟脐橙果实枯水具有重要作用。

柑橘枯水现象最先由美国Bartholomew等[2]报道，其后逐渐受到各国研究者重视。发生枯水的果实汁胞失水，汁胞出现不规则膨大或干枯萎缩，颜色变灰，口感变差[3]，严重影响了柑橘果实的品质和商品价值。柑橘枯水除受自身特性的影响外，也受到外界环境因素的影响。Singh[4]和Ritenour[5]研究发现，气候变化是造成柑橘汁胞枯水现象的重要因素。当春季发生突然高温时，柑橘果实粒化频率显著上升。张名富[6]研究发现，在柑橘果实出现第二次膨大的高峰时期，若突然出现异常少雨干旱的情况，则阻碍果肉中砂囊组织的正常发育，迫使细胞组织发生不可逆转的纤维化，进而导致柑橘果实枯水现象的产生。枯水现象的发生与细胞壁代谢密切相关，随着枯水程度的加剧，果胶甲酯酶（PME）和抗氧化酶（POD、CAT、SOD）的活性增加，同时多聚半乳糖醛酸酶（PG）和纤维素酶（CL）的活性降低[7]。Singh[4]研究发现，柑橘果实枯水与PME的活性呈负相关。El-zeftawi[8]和谭兴杰等[9]研究发现， PE和PG活性的提高会造成枯水发生。茅林春等[10]研究发现，PE活性高而PG活性低时，会造成果汁减少。李春燕等[11]研究发现，不同种类甜橙的PE和PG活性都以成熟期为转折点，纤维素酶（Cx）活性对细胞壁中难溶状态的纤维素含量影响最大。潘鹏飞等[12]以琯溪蜜柚果实为材料，发现低温贮藏情况下，木质素含量、枯水指数以及木质素合成相关酶（PAL、CAD）的活性与室温条件下贮藏相比显著降低。丁健 [13]以‘朋娜脐橙愈伤+‘红橘叶肉的原生质体在PEG融合条件下再生的6棵具有果实早期枯水症状的变异体植株为材料，用朋娜脐橙（Citrus sinensis（L.）Osbeck）作为对照，对两者果实发育过程中细胞壁代谢的变化规律和相关基因表达进行分析，构建了以PME、PG为核心的柑橘粒化发生机理的初步模型。郭金鹏[14]研究发现，不同的发育时期，PE、PG、Cx参与了不同的代谢途径而出现汁胞粒化的现象。Wu等[7]研究发现，随着晚熟脐橙果实枯水程度的加重，枯水相关基因PME、PAL、CAD和POD的表达量均明显上升，CL和PG的表达量则明显下调。

笔者以湖北三峡库区秭归县较高海拔地区伦晚脐橙（Citrus sinensis Osbeck cv.Lane late）为材料，开展花期灌水试验，研究花期灌水处理对伦晚脐橙落果率、枯水情况和果实品质的影响，并对枯水相关基因PME、PAL、CAD、POD、Cx和PG的表达量进行分析，从生理品质和基因表达2个方面初步探讨花期灌水处理减轻伦晚脐橙果实枯水的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）不同海拔的供试材料。采自湖北省宜昌市秭归县邓家坡伦晚脐橙果园，伦晚脐橙均为高接品种，以12年红橘为基砧，“罗伯逊”脐橙为中间砧。于2016年4月21日分别采摘200、300、400 m海拔处果实。选择不同部位大小适中、无明显损伤的果度各45个进行试验，采收当天运至实验室，用于生理生化指标的测定。采样实时进行枯水指数和落果率统计。

（2）灌水处理的供试材料。采自湖北省宜昌市秭归县郭家坝镇王家岭村伦晚脐橙果园，海拔379 m。伦晚脐橙园为12年红橘为基砧，“罗伯逊”脐橙为中间砧，高接伦晚脐橙。以经过花果同树时期灌水处理和未处理果实为材料，在试验后5月20日采收，选择不同部位大小适中、无明显损伤的果试各90个进行试验，采收当天运至实验室，一部分用于生理生化指标的测定;另一部分液氮保存用于基因表达量检测。采样实时进行枯水指数和落果率统计。

1.2 试验方法 处理时间：2016年3月5日、3月20日、4月5日、4月20日、5月5日，从花蕾期到末花期，每隔15 d左右进行灌溉，共5次。采样时间：2016年5月20日。灌水地点：秭归县郭家坝镇王家岭伦晚脐橙园（海拔379 m）。灌水方法：选择生长环境相同、长势一致、生长发育正常的伦晚脐橙树为试验对象，灌水时应充分浸润土壤，对照树不灌水。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 测定指标。①色泽品质指标：果皮亮度值RL、果皮红色度Ra、果皮黄色度Rb、果肉亮度值FL、果肉红色度Fa、果肉黄色度Fb。②内在品质指标：可溶性固形物含量、可滴定酸含量、Vc含量、固酸比。③其他指标：枯水指数、落果率、汁胞含水量、出汁率、单果重、果皮厚、横径。

1.3.2 测定方法。

（1）果皮色泽。使用ZE6000色彩色差计测定。使用前先校准色差仪，设定好程序，每组处理取5个果实，每个果实观测3个值，观测时将果实对准透光孔，根据设定时间旋转果实不同部位测定，注意观察果皮色泽时，要避开果脐处和果柄处。其中，L为亮度变量，a为红色或绿色值（正值为红色，负值偏绿色），b为黄色或蓝色值（正值为黄色，负值偏蓝色），H=tan-1b/a，表示色泽值。

（2）可溶性固形物。用手持糖酸仪测定。在果实不同方位取3～5瓣，剥去果皮，将果肉研磨成果汁，用手持糖酸仪测定，每次测定前需调零，测定前要润洗3次，测3次数值，求取平均值，以减小误差。

（3）汁胞含水量。用MRTTLER TOLEDO卤素水分仪进行测定。将果实汁胞从果肉中用镊子细致地剥取出来，每次取完整汁胞0.2～0.5 g，置于卤素水分仪中，120 ℃烘烤30 min，使汁胞中的水分完全烘干，隔10 s显示值恒定即可，记录下此时显示器上的读数，即为汁胞失水率，每个果实测3次，求平均值，以减小误差。

（4）出汁率。用脐橙专用半自动榨汁机。榨汁之前，称取所需榨汁果实的总重量M，手按榨汁，榨至不再出汁为止，将榨汁机上端残留的果肉渣液用干凈的三层纱布包裹挤压至不出汁，称取汁液质量m，则出汁率=m/M×100%。

（5）可滴定酸。用酸碱中和滴定法测定[14]。平行试验3次，求平均值，以减小误差。

（6）Vc含量。用2，6-二氯靛酚滴定法测定[15]，平行试验3次，求平均值，以减小误差。

（7）横径、果皮厚和单果重。横径及果皮厚用游标卡尺测量，横径卡取果实中部最粗部位，每个果实测3个值，求取平均值，以减小误差;果皮厚在测量时，叠加10片测总厚度，精确读数，求平均值，以减小误差;单果重用千分之一天平称重，称取5个果实的重量，求平均值，以减小误差。

（8）果实汁胞枯水评价。参照陈昆松等[16]的方法，略有改动。将球形果瓣按四等分各取1个果瓣，按果瓣内汁胞的枯水程度将枯水划分为4级：未枯水者为0级;枯水0～10%为l级;枯水10%～25%为2级;枯水25%～50%为3级;枯水50%以上为4级。每处理检查80～100个果，计算果肉枯水指数：枯水指数=Σ（枯水级别×该级别果数）/（最高级别×检查果实数）。

1.4 PCR检测

（1）RNA提取。取保存于-80 ℃的伦晚脐橙果实样品，使用液氮磨样并分装，随后按照说明书的方法使用Trizol（Life，USA）提取总RNA。使用NanoDrop 2000（Thermo Fisher，USA）检测RNA的浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

（2）反转录。以质量合格的总RNA为模板，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo Fisher，USA） 去除RNA中的基因组DNA并反转录合成cDNA，具体做法按照说明书进行操作。利用NanoDrop 2000测定cDNA浓度，并将浓度调至200 ng/L左右，置于-20  ℃低温冰箱中备用。

（3）PCR反应。根据相关基因的序列，用Primer 5.0设计引物（表1）。以上述合成的cDNA为模板，用SYBR Green Realtime PCR Master Mix （Thermo Fisher，USA）进行PCR扩增。反应体系：Es Taq Master Mix 5 μL、正反向引物各0.4 μL、cDNA模板1.0 μL、ddH2O  8.2 μL。每个处理做3个生物学重复，使用actin-β基因作为内参。

1.5 统计分析 显著性分析及相关性分析用SPSS 17.0软件进行分析;PCR分析用QUANTITY ONE软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同海拔对晚熟脐橙枯水指数和落果率的影响 对不同海拔晚熟脐橙的枯水情况及落果率进行分析，确定需要进行灌水处理的合适海拔。由表2可知，在海拔200 m处，果实尚未发现枯水现象，此时的落果率为12.73%，属于正常生理落果;而在海拔300 m处，果实已经表现出较为明显的枯水症状，枯水指数为1.76，且落果率较高;400 m处枯水现象已比较严重，枯水指数达2.70，且伴随着明显的异常落果现象。

2.2 花期灌水对伦晚脐橙枯水指数和落果率的影响

针对高海拔引起的晚熟脐橙果实枯水及异常落果情况，在湖北省宜昌市秭归县郭家坝较高海拔处的伦晚脐橙园（用Garmin公司生产的GPS卫星导航仪测得海拔高度为379 m），开展了伦晚脐橙花期灌水处理，以不灌水处理为对照，分析花期灌水对晚熟脐橙枯水指数和落果率的影响。结果表明， 花期灌水可以显著降低伦晚脐橙枯水指数和落果率，灌水处理的伦晚脐橙枯水指数从1.73降至0.67，落果率仅为11.71%，比对照降低了50.61%，由此可见，灌水处理能显著降低枯水指数和落果率（表3）。

2.3 花期灌水对伦晚脐橙内在品质的影响

可溶性固形物主要是指各种可溶性糖类及有机酸，是衡量果实品质的一个重要指标[17]。花期灌水可以显著提高伦晚脐橙果实的可溶性固形物含量，与对照相比提高了约8.0%;Vc含量和固酸比含量也有一定的提高，但未达显著水平，而可滴定酸含量则保持不变。说明经灌水处理后，有利于伦晚脐橙果实中营养物质的积累与合理分配，糖度和酸度比例适中，增加了风味和口感，显著改善了伦晚脐橙的内在品质（表4）。

2.4 花期灌水对伦晚脐橙色泽品质的影响

对灌水处理下伦晚脐橙色泽品质变化进行分析表明，灌水处理下伦晚脐橙的果肉亮度值与对照相比在0.05水平上差异显著，即果肉粗糙程度明显较小，色差小;而果皮色泽值、果皮亮度值和果肉亮度值均无显著差异。说明经灌水处理后，伦晚脐橙的重要变化是果肉细致均一，色差较小，色泽偏橙红色，同时果皮外表较为光洁鲜亮，果皮光滑，果皮油胞较小而密集，整体色泽品质有所提升（表5）。

2.5 花期灌水对伦晚脐橙其他生理品质的影响

花期灌水下伦晚脐橙果肉出汁率相对于对照显著升高，汁胞的含水率也有一定的提高，说明灌水处理可以使伦晚脐橙汁水丰富，有较好的口感。同时经灌水处理的伦晚脐橙果皮厚度显著低于对照，提高了可食率。对于果实横径和单果重而言，处理果实与对照相比略有增加，但均未达显著水平（表6）。

2.6 花期灌水处理下伦晚脐橙果实品质指标相关性分析

相关性分析结果显示，与灌水处理相关性最大的是枯水指数，其次是果肉亮度值、落果率、果皮厚和可溶性固形物含量，其余相关性不大。枯水指数与灌水处理的相关系数已达-0.950，呈显著负相关，且在0.05及0.01水平上均有显著差异，与品质分析结果一致，说明灌水处理可以显著降低枯水指数。果肉亮度值、落果率 、果皮厚和可溶性固形物含量与灌水处理的相关系数在0.05水平上差异显著，表明灌水处理后伦晚脐橙果肉色差小、果皮厚降低，落果率明显下降，同时可溶性固形物含量显著提高。

其中，不同指标之间的相关性分析中，落果率与可溶性固形物含量，橫径与果皮亮度在0.05及0.01水平上均存在显著相关性。其中，落果率与可溶性固形物含量相关系数最大，呈显著负相关，为-0.967，说明在一定范围内，随着可溶性固形物含量的升高，落果率逐渐降低;横径与果皮亮度值相关系数为0.951，呈显著正相关，说明果皮厚度越厚，果皮的色泽越差。落果率与枯水指数呈显著正相关，相关系数为0.890，说明随着枯水程度的加剧，落果率随之升高;枯水指数与果肉亮度值和果皮厚均呈正相关，与可溶性固形物含量呈负相关，且在0.05水平上显著相关，可以推测可溶性固形物含量越低，果实越容易枯水，枯水情况越严重，则果皮越厚，果皮越容易粗糙色泽不均，色泽越差（表7）。

2.7 花期灌水处理下伦晚脐橙中枯水相关基因的表达分析

为了初步探讨花期灌水处理影响伦晚脐橙果实枯水的分子机理，选取6个已经报道的伦晚脐橙果实枯水相关基因进行PCR检测。结果发现经灌水处理后的伦晚脐橙，PME、PG和Cx的表达量均明显上升，且PG的表达量约为PME的2倍，PAL、CAD、POD表达量则下降，且PAL下调趋势最为明显，表达量为对照的0.67。相关基因的模式表现出向减轻枯水现象发生的趋势，说明灌水处理影响了枯水相关基因的表达。PME和PG的表达量有所上升，说明灌水处理可以加快果胶的代谢，同时，Cx表达量上升且PAL、CAD、POD表达量略有下降，说明细胞壁中纤维素半纤维素和木质素的代谢也受到灌水处理的调节，使纤维素半纤维素和木质素不在细胞壁中大量积累，从而使细胞壁处于正常的代谢平衡中，增强有机体抵抗外界和胁迫的能力（图1）。

3 讨论

伦晚脐橙果实留树越冬，次年3—5月成熟，果实挂树时间长达11个月以上，受自然环境条件的影响较大，低温和海拔对留树果实的影响较大，库区伦晚脐橙果实枯水的发生主要由冬季低温引起，较高海拔处果实品质显著低于较低海拔处[1]。生产中通过一定的栽培技术措施如覆膜、套袋和灌水可以减轻低温对枯水的影响，从而减轻果实枯水程度。黄涛江等[18]在研究三峡库区奉节县晚熟脐橙粒化的原因时发现，开花抽梢期由于养分水分大量消耗，容易使果实发生枯水，品质下降。赵小龙等[19]研究发现，在果实汁胞迅速生长期，由于突发干旱造成的水分胁迫会抑制果实汁胞的发育而形成果实粒化现象，适当灌水可以缓解此现象。该研究发现伦晚脐橙花期需要消耗大量水分，经过花期灌水处理，不仅可以降低果实的枯水指数，还可以显著提高果实品质。

对伦晚脐橙品质的不同指标之间的相关性分析发现，固酸比与落果率和枯水指数均呈负相关，说明在一定范围内，随着固酸比的升高，枯水指数降低，同时落果率也逐渐降低。王武等[20]对冬季覆膜处理下W·默科特杂柑的落果率和品质的研究发现，冬季覆膜处理可以提高固酸比，同时有效降低落果率。枯水指数与含水量和出汁率均呈负相关，说明随着枯水程度的加重，果肉含水量和果实出汁率均明显降低，与王向阳等[21]研究发现粒化的椪柑果皮和果肉出汁率显著下降结果相一致。

研究表明多聚半乳糖醛酸酶（PG）是果实成熟软化的一个关键酶，果实后熟和贮藏期间的硬度下降有关[22]。陈发河等[23]在对葡萄研究时发现， 植物生长调节物质对葡萄浆果脱落的不同调节作用都与PG的变化有关，PG活性表达可引起细胞壁结构的改变及其他细胞壁水解酶的释放，进而加速成熟的后续过程，因此PG是引起果实软化的关键酶[24]。在经灌水处理后的伦晚脐橙中，枯水相关基因的表达量均发生变化。随着枯水的发生，PME、PAL、CAD和POD表现出上调的趋势，而PG和Cx 则表现出明显的下调趋势，纵观整体基因的变化量，仅PG的表达量在3倍以上，远高于其他基因的表达。由此推测PG是在伦晚脐橙枯水发生中影响最大的一个基因。

综上所述，灌水处理可以减轻伦晚脐橙枯水的作用机制可能是在花期进行灌水处理，PME产生的脱甲酯果胶质在高活性PG的作用下顺利分解，加快了果胶的代谢;由于果实中可溶性固形物含量提高，使细胞内渗透压升高，Cx活性升高，使纤维素、半纤维素分解速度加快，不易在细胞壁中积累;同时木质素合成酶PAL、CAD、POD的活性降低，使木质素的合成速度略小于分解速度，及时被分解排出，从而使细胞壁处于正常的代谢平衡中，增强有机体抵抗外界和胁迫的能力。

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