肝脾硬度与急性髓系白血病微小残留病的相关性研究

王宁方 赵崇山 尤月明 王毅军 蔡卓纹 张东东 刘芳

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,Aml)是发生于造血干/祖细胞的恶性增殖性疾病，完全缓解(CR)后复发是影响患者长期生存重要因素。微小残留病(minimal residual disease，MRD)是复发的主要根源。微小残留病是指白血病经诱导化疗获完全缓解后或骨髓移植治疗后体内仍残留<109的白血病细胞。白血病患者白血病细胞可延沿肝脾血窦分布，弥漫性浸润血管、肝小叶、脾索，肿瘤细胞不断增殖，可形成结节，并向邻近的 组织浸润，有时甚至形成肿块[1]。邓怡等发现在 L615 细胞低瘤负荷的MRD小鼠模型中，骨髓移植后17 d肝脏正常结构破坏，肝窦内存在大量白血病细胞，脾脏白髓和红髓等正常结构消失，有大量白血病细胞[2]。不管是白血病或MRD，均可发现白血病细胞肝脾浸润，引起肝脾损害，进而引起影像学改变。2003年法国学者Sandrin等[3]根据声波传导速率与组织硬度相关的原理，发明一种切变弹性探测仪，发现测量值与肝纤维化分期显著相关。FS检测作为一种瞬时弹性成像技术可以通过检测肝脏及脾脏对超声波传导的速度推测肝脏及脾脏硬度，以其无创检测的优势在肝病领域应用较广泛。普通体检人群中也有应用研究。目前尚无关于Aml患者肝脾硬度检测及其与MRD相关性的研究。本研究分别以Aml患者、慢性肝病肝硬化及健康人群作为研究对象，检测3组人群肝脾硬度情况，用流式细胞仪行MRD检测，进一步分析Aml患者不同时间点肝脾硬度与MRD的相关性，进一步评估预后，指导诊疗，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院收治的初治急性髓系白血病(除外急性早幼粒细胞白血病M3)患者共100例为试验组，男62例，女38例；年龄23～66岁，平均 (44.14±12.17) 岁；免疫分型FAB分型 ：M0 3例，M1 15例，m248例，M4 18例，M5 16例[4]。阴性对照组为我院体检健康志愿者30例，其中男20例，女10例；年龄19～63岁，平均(42.32±10.49)岁。阳性对照组为慢性肝病、肝硬化者30例，其中男21例，女9例；慢性肝病18例，肝硬化12例；年龄22～65岁，平均(45.39±11.43)岁。3组患者的年龄、性别比等基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 Aml参照WHO(2016)造血和淋巴组织肿瘤分类标准，诊断外周血或骨髓原始细胞比例下限为0.2，当患者被证实有克隆性重现性细胞遗传学异常t(8;21)(q22;q22)、inv(16)(p13q22)、t(16；16)(p13q22)，即使原始细胞<0.2，也应诊断为Aml。所有患者初诊时均行血常规、生化、出凝血、外周血涂片、骨髓细胞形态学、细胞免疫分型、细胞/分子遗传学等检查[4]。慢性肝病肝硬化的诊断依据《肝硬化中西医结合诊疗共识》[5]确诊。慢性肝炎的诊断依据《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[6]的诊断。

1.3 纳入及排除标准

1.3.1 纳入标准:试验组：经过骨髓细胞形态学、细胞免疫分型、细胞/分子遗传学等检查明确诊断Aml(非M3)者。慢性肝病肝硬化失代偿期，肝功能Child-Pugh B、C 级。阴性对照组：健康体检正常者。以上入组的研究对象均自愿参加，并自愿签署知情同意书。

1.3.2 排除标准:急性早幼粒细胞白血病，复发急性髓系白血病，急性髓系白血病合并自身免疫性肝病、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝炎等急、慢性肝病。阳性对照组除外并发上消化道出血、肝性脑病、自发性腹膜炎、肝肾综合征和原发性肝癌等患者。

1.3.3 脱落、剔除及中止标准:如经知情同意、并筛选合格进入随机化试验的受试者，因故未完成本方案所规定的疗程及观察周期，作为脱落病例；如不符合纳入标准而纳入，未遵循试验方案者予以剔除；患者要求退出试验，或未按规定时间随访，死亡者，视为中止。

1.4 方法

1.4.1 相关指标检测:试验组在首次诱导缓解治疗结束后第14天、巩固治疗结束后行骨髓穿刺术，抽取肝素抗凝骨髓血3 ml，利用流式细胞术 (FCM)行MRD检测。试验组在首次诱导缓解治疗结束后第14天、巩固治疗结束后行骨髓穿刺术，抽取肝素抗凝骨髓血3 ml，利用流式细胞术 (FCM)(美国Becton,Dickinson and Company)行MRD检测。白血病相关免疫表型(leukemiaassociated immuno phenotypes，LAIP)的确定依据其初诊时的免疫表型资料。选取2个或以上的LAIP组合作MRD的检测，首选淋巴细胞系交叉抗原阳性细胞，其次选择表达缺失的抗原以及不同期表达抗原。采用BD CellQuest Pro软件进行数据的获取和分析。设定参考值以 MRD≥10-4为阳性。按MRD水平<10-4，≥10-4且<10-3,≥10-3且<10-2，≥10-2分为A、B、C、D 4组。

1.4.2 肝脾硬度检测：分别对试验组患者初诊时及首次诱导缓解治疗结束后第14天、巩固治疗结束后进行，随机检测对照组肝脾硬度情况。仪器：FibroScan肝脏瞬时弹性检测仪(法国Echosens公司)。受检者空腹。取仰卧位，检测肝硬度时，高举右臂，最大限度扩展肋间隙，将右侧腋前线至腋中线第7～9 肋间作为检测区域，同一位置至少获取10次成功测量，采取中位数作为最终测定结果。检测脾硬度时，高举左臂，以左侧腋后线9～11肋间隙作为检测区域，余同脾硬度检测。若检测四分位数间距≥中位数值的1/3， 或成功率<60%，表明此次弹性测定值无效[7]。

1.4.3 结果分析:分析初诊时试验组与对照组肝脾硬度情况及临床相关性；分析试验组诱导缓解前后肝脾硬度的变化，分析不同时间点不同MRD水平组肝脾硬度的区别及脾-肝硬度不同分组间MRD的差异。

2 结果

2.1 初诊时试验组与对照组肝脾硬度比较 3组肝硬度及脾肝硬度差值比较差异显著，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，试验组肝硬度低于对照组(P<0.05)，脾肝硬度差值高于对照组(P<0.05)试验组脾硬度高于阴性对照组及阳性对照组,但比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 初诊时试验组与对照组肝脾硬度比较

2.2 试验组不同治疗时期肝脾硬度比较 试验组患者在诱导缓解后及巩固治疗后，脾硬度及脾肝硬度差值皆有下降的趋势，不同时期比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 试验组不同治疗时期肝脾硬度比较

2.3 试验组不同MRD组间肝脾硬度比较的差异 统计显示，试验组不同MRD组间脾硬度及脾肝硬度差值皆有升高的趋势，其中脾-肝硬度差值比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 试验组不同MRD组间肝脾硬度比较的差异

3 讨论

Aml是由髓系造血干细胞前体异常克隆造成的是一种骨髓异常增生性疾病，病因尚不明确，近年来研究认为可能是环境和遗传共同作用的结果。白血病细胞存在血液循环中，在骨髓及其他造血组织中大量繁殖积聚，并浸润其他脏器及组织，使得正常造血机制受到抑制[8]，其中肝脏和脾脏浸润最为常见。童佳佳等[9]通过影像学研究证实，约一半的白血病患者发生脾浸润，表现为脾脏体积增大或放射性摄取增高，脾脏越大则预后越差，生存期越短。且脾脏为白血病细胞增殖提供了一个有力的生存环境，并使其在骨髓、血液、脾脏之间往返循环。

肝脏是人体最为活跃的器官，具有多种代谢功能及双重血液供应功能；脾脏是人体最大的淋巴器官，为网状内皮系统的重要组成部分，是人体的血库。Aml患者肝脾肿大的可能原因为：Aml患者骨髓造血出现障碍，导致严重贫血，肝、脾可恢复造血功能，产生髓外造血，导致增生性肝、脾肿大。肝脏血运丰富，脾脏是血细胞的储存场所，脾充血可使脾肿大，而恶性血液病导致淋巴结肿大，造成局部压迫，使得肝静脉回流受阻或脾静脉受阻，可引起脾脏肿大。此外，Aml化疗的同时也会对肝细胞产生细胞毒性，引起肝细胞损伤、 变性，甚至坏死等改变。其病理基础为肿瘤细胞增生和浸润、出血，血管内淤滞[10]。

弹性是人体器官组织重要的物理特征之一，不同的器官组织弹性也不同。Aml患者肝脾瘀血，肿大，组织增生和大量纤维结缔组织的形成，使其密度增加，弹性改变。近些年，关于利用超声弹性成像技术无创评估病变区组织的硬度的研究越来越多。有实时组织弹性成像技术、FS和声脉冲辐射力成像技术等[11,12]。FS使用弹性波和超声波进行工作。仪器通过探头振动轴发出低频率低振幅弹性波，弹性波进入体内在组织中传播，探头上的超声换能器进行连续的超声采集以跟踪弹性波的传播并测量其速度，并使用特定的运算法则将速率转变为硬度值。因其无创、无痛、定量、可多时间点重复测量，其在肝组织上采集信息的体积为肝穿刺标本量的100倍左右，能够通过检测肝脏硬度值来判断肝纤维化，效能优于各种血清生物学标志物，与肝脏组织生物学相关性较好[13,14]。也是测定非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肝炎后肝硬化的有效方法应用，弹性值与肝硬化程度存在相关性。已有用FS检测脾硬度的报道，发现慢性肝病患者肝脾硬度存在显著正相关，且随着肝硬化程度增加，肝脾硬度值增加[15]，结合肝脏硬度及脾脏硬度的检测并进行评分，可以预测食管胃底静脉曲张破裂出血[16]。Colecchia等[17]发现脾硬度或可用来预测HCV 感染失代偿性肝硬化的发生，准确性与门脉压相当。在肝病方面，肝脾硬度检测或可部分替代肝穿活检、门脉压测定、胃镜等有创操作[18]。FS在血液病方面，仅有关于造血干细胞移植后肝纤维化方面的报道，如Pillon M等用FS对造血干细胞移植后患儿行肝脏硬度检测，发现肝纤维化发生比例很高(9/12)，笔者尚未发现检测Aml MRD患者肝脾硬度及分析其与MRD相关性的研究。本研究初步研究显示，Aml组脾-肝硬度与对照组不同，肝硬度低于对照组(P<0.05)，脾硬度、脾肝硬度差值高于对照组；而经诱导化疗及巩固治疗后，Aml患者脾硬度、脾肝硬差值均较化疗前下降。提示脾硬度、脾-肝硬度下降可能提示病情缓解。

随着时代的进步，白血病的治疗不仅是提高完全缓解率和延长患者的生存时间，还包括控制MRD，最终治愈白血病。MRD是白血病复发的根源，是影响患者生存的重要因素。研究发现，Aml巩固治疗后MRD水平与无复发生存和总生存都相关，巩固治疗后MRD>3.5×10-4患者复发危险(77%)明显高于MRD小于3.5×10-4者(17%)[19]。San Miguel等[20]根据诱导治疗后MRD水平，将患者分为<10-4，≥10-4且<10-3,≥10-3且<10-2，≥10-24组，统计显示3年累积复发率分别为0、14%、50%、84%，提示MRD水平是Aml的独立预后因素。对Aml治疗后MRD进行动态监测，并依据MRD水平对白血病缓解后实行动态分层治疗，有望减少复发，延长患者生存。MRD的精确检测有助于更早的发现药物耐药性，更早预测白血病复发，指导诊疗。白血病患者病初体内有1012白血病细胞，诱导缓解后白血病细胞降至1010，形态学检测就难以发现了。流式细胞仪利用白血病细胞免疫表型辨别白血病细胞，灵敏度可达10-4，即便如此患者体内仍可能存在108的白血病细胞，且白血病治疗过程中及复发时免疫表型可能会发生变化，由此造成假阴性结果。故寻找新的辅助检测方法动态监测MRD非常重要。FS检测肝脾硬度相对无创，可多时间点重复操作，或可用来辅助MRD监测。本研究监测不同MRD水平的肝脾硬度，显示随着MRD水平的升高，脾硬度及脾肝硬度差值皆有升高的趋势，提示肝脾硬度可能与MRD相关，肝脾硬度升高可能提示疾病复发。

综上所述，采用FS检测可能为急性髓系白血病MRD新的辅助判断预后，指导诊疗的无创检测指标，有待进一步扩大样本量研究。