乳腺癌进展后相关受体转化及影响因素研究

崔志超 李泽源 王雅琪 马杰 谷峥 周立芝 陈晶晶

乳腺癌的发病率上升了约3倍[1]，在全世界越来越多的患者被诊断为浸润性乳腺癌，虽然对于早期乳腺癌的治疗已经日益完善，大量针对患者个性化治疗的工作，譬如说新药物开发以及新的手术方式的改革也正在进行，但针对转移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)患者的治疗策略仍有待进一步完善。MBC的治疗是复杂的，很少有公认的治疗标准，特别是在第一线治疗后。乳腺癌晚期患者的治疗策略的选择与多个因素相关，如人类表皮生长因子受体2(guman epidermal growth factor receptor-2,HER2)状态、激素受体状态、无病间期，数量和部位的转移，疾病的症状，生理年龄，状态和以前的治疗，必须考虑为确定MBC的患者选择最佳的治疗管理策略。雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)状态和HER2状态是将乳腺癌分为需要不同治疗的3个主要亚组的关键：HER2阳性癌、激素受体阳性癌和三阴性乳腺癌。乳腺癌的转移复发通常是通过生物学及影像学诊断的[2]。目前治疗指南尚不推荐手术治疗转移复发型乳腺癌[3]，大多数情况下，转移性复发的组织病理学证据是不需要的，转移治疗的选择是基于原发肿瘤的免疫表型。然而，转移性疾病的活检可以有三个目的：确认癌症的诊断，确认病变是原发癌的转移，并重新评估肿瘤的特征。有研究提示激素受体状态在原发灶和复发转移性灶的差异可达到40%[4,5]。HER2表达的异质性虽然罕见，但是也有报道[6]。这种激素受体状态和HER2状态的改变是有重要意义，这可能导致治疗策略的改变[7]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 唐山市人民医院2008年1月至2015年1月收治的晚期乳腺癌患者，经组织病理学确诊，选出具备原发灶与转移灶免疫组化结果的147例患者。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：(1)年龄>18岁；(2)初次手术病理检查确诊为乳腺癌的患者；(3)病灶为单侧；(4)转移灶病理证实为乳腺转移癌。排除标准：既往有其他恶性肿瘤病史的患者。

1.3 设备与试剂 兔抗人HIF-1α单克隆抗体、兔抗人BCL-2单克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司。SABC免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

1.4 研究方法 所有患者转移灶经专用空芯针穿刺取病理活检，病理标本均行免疫组化检测。采集到的患者病理组织常规制成蜡块，组织切片，在68℃下烤片12 h，常规行二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，放置于98℃的EDTA缓冲液中煮沸3 min，自然冷却20 min，冷水冲洗高压锅至室温，PBS冲洗3次，2 min/次，以修复抗原。阻断灭活内源性过氧化物酶，滴加一抗，室温放置3 h，使用PBS冲洗3次，2 min/次，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，2 min/次，给予DAB反应染色，常规脱水，透明、干燥、封片。由两名经验丰富的病理医师进行阅片，并协商判定免疫组化结果。所有操作均由本院病理科完成。

1.5 免疫组化结果判定 ER、PR在细胞核上出现棕黄色染色为阳性，判断标准为ER阳性率≥1%，PR阳性率≥1%。HER2表达在细胞膜上出现黄色或者棕色染色的细胞为阳性，阳性细胞数量≤10%为(-)，11%～25%为(+)，26%～50%为(++)，>50%为(+++)。(+++)被认为阳性，(-)、(+)型被认为阴性。HER2(+++)认定为阳性。HER2(++)则行免疫荧光原位杂交(FISH)检测确认阳性者入组。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料以百分率表示，受体的不一致率采用χ2检验进行分析，体表达差异的影响因素用Logistic 回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者及肿瘤的一般临床特征 147例患者，中位首诊年龄为 49(28～82)岁，转移灶活检中位年龄56(31～82)岁。转移灶收集部位为区域淋巴结、患侧胸壁、对侧乳房、肺、骨、肝、胸膜、皮肤及软组织、脑等。乳腺肿瘤的复发转移主要以区域淋巴结为主，约占总病例数的27.89%。远处脏器的转移常经影像学诊断，缺乏明确地病理学证据，所以入组病例数较少。在收集资料的过程中发现影像学诊断远处转移最常见的器官是肺。见表1。

表1 乳腺癌复发转移灶部位采集及分布情况 例

2.2 乳腺癌原发灶相关受体免疫组化情况 激素受体阳性乳腺癌(Luminal型) 病例102例， HER2过表达型乳腺癌病例14例，三阴型乳腺癌病例24例。其中接受化疗有134例，单独接受蒽环类药物化疗的有46例，单独接受紫衫类药物化疗的有35例，同时接受蒽环类药物及紫杉类药物治疗的有53例。见表2。

表2 乳腺癌原发灶相关受体免疫组化情况 例

2.3 患者接受内分泌治疗情况 接受内分泌治疗的有109例，单独行他莫昔芬内分泌治疗的有40例，单独行芳香化酶抑制剂(Arimedex,AI)类药物内分泌治疗的有36例，行他莫昔芬联合卵巢抑制内分泌治疗的有12例，行AI类药物联合卵巢抑制内分泌治疗的有21例。接受曲妥珠单抗靶向治疗的有58例。见表3。

表3 患者接受内分泌治疗情况 例

2.4 原发性肿瘤与转移性复发的受体表达状态比较 有65例患者原发灶和转移灶之间存在一个或多个受体状态的不一致。有18例ER受体状态由阳性转为阴性，有14例ER受体状态由阴性转为阳性，ER的总不一致率为21.77% (χ2=29.47,P<0.01)。有24例PR受体状态由阳性转为阴性，有10例PR受体状态由阴性转为阳性，PR的总不一致率为23.13% (χ2=30.14,P<0.01)。有14例HER2受体状态由阳性转为阴性，有6例HER2受体状态由阴性转为阳性，HER2的总不一致率为13.61% (χ2=52.04,P<0.01)。见表4。

表4 原发灶和复发转移灶受体表达状态的不一致率 例(%)

2.5 与受体的表达不一致的相关因素 在单变量分析中，Logistic 回归分析与ER、PR、HER2的不一致相关的因素。ER受体不一致表达与化疗、内分泌治疗、靶向治疗等均未见明显相关性(P>0.05)。PR和HER2受体的不一致率与化疗的相关性无统计学意义(P>0.05)。PR受体不一致表达与内分泌治疗相关，且他莫昔芬药物的应用与PR受体不一致表达显著相关(P<0.05)。HER2受体不一致表达与曲妥珠单抗的应用相关(P<0.05)。见表5。

表5 与受体的表达不一致的相关因素的单因素分析

3 讨论

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，女性发病率为99%，有数据统计，全世界每年有138万的新发病例，45万死亡病理，占女性死亡人数的1.7%[8]。而乳腺癌的发病率速度增长极快，每年的增长率约为3%左右[9]。乳腺并非人类生存的必须器官，所以乳腺癌理论上不会危及生命，但是如果癌细胞发生脱落、转移到其他脏器，则预后较差[10]。

乳腺癌具有高度的异质性，在组织形态、免疫表型等方面会出现很大差异，这也就导致了对化疗药物的敏感度差异较大[11]。对于乳腺癌的分型目前以免疫组化和基因芯片技术的手段，依据乳腺癌的ER、PR、KI-67、HER-2的状态分为4个亚型，Luminal亚型，即ER和(或)PR阳性，HER-2过表达型，即HER-2阳性， ER、PR、HER-2均为阴性，也被称为三阴性乳腺癌。在乳腺癌患者中，HER-2过表达型的患者约有25%～30%的患者，而研究已经证实HER-2的过表达与乳腺癌细胞的增生密切相关，同时HER-2的过表达与ER、PR呈负相关，HER-2过表达的乳腺癌被发现更容易发生复发、转移，患者的无病生存期明显短于其他种类的乳腺癌患者[12]。

HER-2是一种跨膜糖蛋白，由原癌基因C-erbB2编码，具有受体酪氨酸激酶活性[13]。在正常细胞内，HER-2蛋白起到将生长信号从细胞外运送至细胞内的作用，从而促进细胞进行正常的生长和分裂活动[14]。一旦HER-2发生过表达，则会刺激细胞疯狂增长，细胞侵袭性明显增加，容易发生转移，不易被药物杀死。HER-2的过表达已经被证实是乳腺癌患者预后的不良因素之一。对于HER-2过表达的患者，除了常规的手术和放化疗治疗外，近年来应用分子靶向药物进行联合疗效，改善了患者预后。

ER是一种蛋白质分子，存在于靶器官的细胞内，能够与激素发生特异性结合，形成激素-受体复合物，使激素能够发挥其生物学效应，其蛋白质在翻译后短暂位于胞浆，扩散到细胞核的雌激素与其核受体结合后会引起基因调控机制出现，对下游的基因转录进行调控。PR是核受体超家族成员之一，是雌激素与雌激素受体结合诱导后所得到的产物，期合成必须以雌激素作为起到因子，而雌激素在体内一系列作用的最终产物之一既是PR蛋白。在介导与调节卵巢、子宫、乳腺等方面的功能和生殖活动中具有重要的意义。

乳腺癌的复发转移过程中，常伴随着 ER、PR、HER2 在原发灶与转移灶表达的差异，这些差异发生的内在机制、对预后的影响以及对后续治疗策略的影响等诸多问题亟待解决，这也恰恰是本研究的关注点。在这项回顾性研究中，原发性乳腺癌和转移性病变中在ER、PR、HER2状态不一致，分别有21.77%、23.13%、13.61%出现了原发灶和转移灶的受体表达不一致。ER受体、PR受体主要是由阳性转为阴性为常见(ER:12.24% vs 9.52%，PR:16.33% vs 6.8%)，这与以往报道的变化趋势[15-17]相一致。许多文献还详细报道了受体由阳转阴或由阴转阳的比例或病例数，从中可以看出激素受体由阳性转为阴性的比例较高这一普遍现象[18-23]。本研究得出PR的不一致率比ER的不一致率更高，可能是因为伴随肿瘤的进展，PR通路对表达改变有更强的易感性[24]。与原发灶相比，移灶中PR阴性的肿瘤更常见。导致PR缺失的原因可能是调节PR的生长因子出现下调[25]。本研究中Logistic回归分析得出仅PR的表达不一致性与术后辅助内分泌治疗有关(P=0.007；OR=3.939，5%CI：1.464～10.594)，后辅助内分泌治疗的患者，PR在原发灶与转移灶的表达更易出现差异。尤其是在应用他莫昔芬为内分泌治疗方案的患者中，PR受体表达由阳性转为阴性较为多见，我们推测，他莫昔芬或作为影响PR受体表达的关键因素。Lower等[18]也得到了与我们的研究结果相一致的结果，PR 的表达水平(在三苯氧胺治疗期间)表现出急剧的下降，随着耐药的出现，一半肿瘤的PR 的表达水平完全缺失。我们的研究结果提示ER表达差异与蒽环/紫杉类化疗、内分泌治疗、靶向治疗均无明显关系，一些文献报道[21,26,27]相一致。但多数文献还是认为HR的改变与系统治疗(化疗、内分泌治疗)相关[15,23,24,27-30]。在本项研究中HER2 由阳性转为阴性的比例较高(6.7% vs 5.6%)，但是比例相差不大，这与以往的研究结果[13,27-31]不一致。以往的研究报道HER2 由阴性转为阳性的比例较高[13,27-31]。Logistic分析结果显示HER2 的表达差异与蒽环/紫杉类化疗、内分泌治疗均无明显关系，与抗HER2 治疗相关，这与Curtit等[29,32,33]研究结果相符。但也有研究提示蒽环、紫杉类联合曲妥珠单抗的新辅助化疗使 32%的HER2 阳性的患者转为阴性[34]，关于这一问题有待大样本量的研究进一步探索。

总之，本研究证实乳腺癌原发肿瘤和相应的转移灶之间的ER、PR 、HER2表达的不一致性高。重要的是，我们表明了以他莫昔芬为基础的内分泌治疗与PR受体的表达状态密切相关，抗HER2 治疗与HER2受体的表达的不一致性相关。关于既往治疗对乳腺癌相关受体转化有无影响及其分子机制仍值得进一步研究。