尿激酶、低分子肝素对脓毒症弥散性血管内凝血大鼠模型的影响研究*

尤金枝，王捷虹，高麦仓，王瑞哲，任耀龙，王晨曦，王 博，梁嘉斌，刘 旺，于 勇

陕西中医药大学附属医院(咸阳712000)

脓毒症是由感染引起的宿主反应失调，可导致危及生命的器官功能障碍[1-3]。每年约有1800万人罹患脓毒症[4]，而脓毒症休克是急危重症医学领域的棘手问题[5]，是重症医学科危重病患者的首要死因[6]，临床病死率高[7-8]。脓毒症导致的弥散性血管内凝血(Diffuse intravascular coagulation，DIC)占发病总数的25%～50%，如何有效防治脓毒症所致DIC很有研究价值。基于此，我们进行尿激酶(Urokinase，UK)及低分子肝素(Low molecular weight heparin，LMWH)对脓毒症DIC大鼠模型的干预效应研究，为临床规范应用提供实验支撑和理论依据。

材料与方法

1 研究材料

1.1 动物及分组：健康SD大鼠100只，雌雄各半(排除孕鼠)，体质量180～200 g，周龄7～8周。将动物随机分为六组：生理盐水(Normal saline，NS)对照组30只，分为NS(1 h)、NS(2 h)、NS(4 h)三个亚组，各10只；脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)造模组30只，分为LPS(1 h)、LPS(2 h)、LPS(4 h)三个亚组，各10只；尿激酶组(UK)10只；脂多糖造模+尿激酶组(LPS+UK)10只；低分子肝素组(LMWH)10只；脂多糖造模+低分子肝素组(LPS+LMWH)10只。

1.2 药物：低分子量肝素钙注射液(国药准字H20163060)，注射用尿激酶(国药准字H32021989)，戊巴比妥。

1.3 试剂和仪器：血浆凝血酶原时间(Prothrombin time，PT)、活化部分凝血酶原时间(Activated partial prothrombin time，APTT)、纤维蛋白原(Fibrinogen，FBG)、D-二聚体(D-dimer，DD)、血小板(Platelet，PLT)试剂，内毒素；全自动凝血分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司， RAC-1800)，电子分析天平(上海佑科仪器仪表有限公司， FA2004B)，离心机(德国Thermo Fisher Scientific公司，75002440)，移液枪(德国艾本德股份公司，Eppendorf AG)，全自动正置显微镜(日本Nikon eclipse，90i)。

2 研究方法 实验前空腹12 h，1%戊巴比妥(30 mg/kg)经腹腔麻醉后按分组用微量泵经尾静脉输入生理盐水或药物。与NS组比较，同时存在以下三项以上异常，即判断造模成功： PT延长3 s以上； APTT延长5 s以上；FBG下降超过25%； PLT明显降低； DD明显升高；器官组织切片显示微血管中出现纤维蛋白微血栓。输注方法：①NS组：NS 2.5 ml/h×4 h；②UK组：NS 2.5 ml/h，在输注1 h后，加入UK 10 IU/(g·h)×3 h；③LPS组：LPS 30 mg/(kg·h)×4 h；④LPS+UK组：LPS 30 mg/(kg·h)，在输注1 h后，加入UK 10 IU/(g·h)×3 h；⑤LMWH组：NS 2.5 ml/h，输注1 h后加入LMWH 50 IU/(g·h)×3 h；⑥LPS+LMWH组：LPS 30 mg/(kg·h)，输注1 h后加入LMWH 50 IU/(g·h)×3 h。NS和LPS亚组分别于输注后1 h、2 h、4 h，UK、LPS+UK、LMWH、LPS+LMWH各组分别于输注后4 h，经腹腔静脉采集血样，血液标本一部分以3000 r/min离心15 min，取上清液置于-20 ℃冰箱内保存、备测，另一部分以3.8%枸橼酸钠1∶5抗凝或EDTA抗凝待测。

3 观察指标 对比各组PT、APTT、PLT、DD、FBG、纤维蛋白原降解产物(Fibrinogen degradation product，FDP)及出血率。

4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差表示，采用t检验。计数资料以例(%)表示，采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 输注LPS后凝血及纤溶指标变化情况 见表1。随着输注时间的延长，与NS组比较，LPS组PT、APTT逐渐延长，DD逐渐增加，FBG、PLT逐渐降低。这种变化在输注1 h开始出现，2 h达高峰，在2～4 h呈平台趋势，表明LPS持续泵入1 h后即可达到脓毒症DIC的诊断标准。

表1 LPS组与NS组凝血及纤溶指标比较

2 UK、LMWH干预前后凝血及纤溶指标变化 见表2。与NS(4 h)组比较，UK组和LMWH组PT、APTT延长(均P<0.05)，而FBG、FDP、DD、PLT改变不明显(P>0.05)，且UK组较LMWH组 PT、APTT延长更明显，但无统计学差异(P>0.05)；LPS(4 h)组PT、APTT延长，FBG、PLT下降，DD升高。与LPS(4 h)组相比较，LPS+UK组和LPS+LMWH组PT、APTT缩短，FBG、FDP、PLT升高，DD下降(P<0.05)，但未恢复到NS组水平，提示UK、LMWH可改善DIC模型大鼠凝血及纤溶功能。

表2 各组给药后凝血及纤溶指标比较

3 出血率比较 见表3。在研究过程中，UK组和LPS+UK组7只大鼠出现了睑结膜充血、腹部皮肤青紫及肺出血的情况，而LPS组和LPS+LMWH组大鼠未出现类似情况，LMWH组和LPS+LMWH组与NK组和LPS+UK组出血率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，表明LMWH较UK更安全。

表3 UK组和LPS+UK组与LMWH组和LPS+LMWH组出血率比较[例(%)]

讨 论

脓毒症是ICU患者主要死因[9]。近年来，随着对脓毒症发病机制的研究不断深入，逐渐认识到脓毒症是感染病原体与宿主免疫系统、炎症反应、凝血反应之间相互作用，相继启动炎性细胞，损伤内皮细胞，启动凝血，从而形成一整套造成机体器官功能损害的复杂临床综合征[10]，机体炎症反应失衡和凝血系统功能紊乱都是脓毒症发病的重要机制的中间环节，而两者之间的相互作用关系更是临床DIC以及进一步发展为多器官功能障碍综合征的重要标志之一[11]。DIC是脓毒症发生、发展的关键环节[12]，随着病情进展，合并DIC的脓毒症，其病死率高[13]。因此，正确评估脓毒症严重程度，严密监测凝血功能，早期发现并及时干预DIC，对患者预后具有非常重要的意义。在脓毒症中，凝血启动与炎症反应的交叉、微血栓的形成需要采用抗凝剂治疗，以避免各种因子出现瀑布样激发，从而减弱器官功能障碍及损伤。目前，部分国内外学者致力于研究适于临床广泛应用且安全有效的抗凝剂，以治疗严重脓毒症。重症感染患者早期应用抗凝剂治疗可能会受益[14]。袁凯锋等[15]研究表明，尿激酶对改善LPS诱导的Wistar大鼠DIC模型出现的凝血及纤溶异常、器官功能障碍具有积极作用。而对于高危患者合并DIC但无出血症状者，推荐使用预防剂量肝素或小剂量低分子肝素[16]。段圣洁等[17]研究表明，新生儿脓毒症合并DIC采用低分子肝素治疗，抗凝效果显著，安全性高。

尽管对于凝血功能紊乱和炎症反应在脓毒症并DIC中发病机制的研究取得了一定的进展，但对于初期凝血功能紊乱的检查手段非常有限，无法寻得真正有效的解决途径。在之前的临床研究中，我们在排除禁忌证的情况下，对于脓毒症患者及时予以UK或LMWH治疗[18]，疗效确切，但其作用机制有待在实验动物模型上进行更深入的研究。基于此，我们进行UK及LMWH对脓毒症DIC大鼠模型的干预效应研究，通过建立脓毒症DIC大鼠模型，检测凝血指标、纤溶指标等，分析其对微循环障碍及纤溶活性的作用，考察UK、LMWH对脓毒症DIC大鼠模型的影响。在LPS持续泵入1 h后，即达到脓毒症DIC的诊断标准，表明造模成功；随着输注时间的延长，与NS组比较，LPS组PT、APTT逐渐延长，DD逐渐增加，FBG、PLT逐渐降低；经UK、LMWH干预后，PT、APTT缩短，FBG、PLT升高，DD下降，与LPS组比较，差异具有统计学意义；LMWH组和LPS+LMWH组的出血率低于NK组和LPS+UK组，差异具有统计学意义。本研究结果表明，UK和LMWH均可防治脓毒症DIC。然而，因为DIC分为高凝期、消耗性低凝期、继发性纤溶亢进期，因此对于无抗凝禁忌证的脓毒症并发DIC高凝期患者，可早期应用抗凝剂(尿激酶或低分子肝素)，对预防DIC形成有积极意义，其通过改善微循环并干预纤溶活性而发挥防治DIC的作用。另外，UK对于已形成的血栓有溶栓作用，但高剂量的UK可能增加出血风险[19]，对于防治DIC、改善微循环，LMWH可能是更安全的选择。