小鼠模型中神经酰胺对血小板介导的输血相关急性肺损伤的作用

李应明陈 华伍 燕

(海南省海口市人民医院输血科,海口 570208)

输血相关急性肺损伤(transfusion-related acute lung injury, TRALI)定义为输血后前6 h 内发生的非心源性肺水肿,是严重的输血不良反应,也是输血相关死亡的首要原因[1-2]。 根据2015 年美国美食品药品监督管理局报道,输血引起的病毒感染显著下降,而输血导致的致死性不良反应中位居前三位的依次是输血相关急性肺损伤、溶血性输血反应和输血相关脓毒血症。 多项研究发现血小板制品中含有的多种免疫调节因子,诸如如血小板衍生的生长因子、可溶性CD40 配体、白介素-6 和白介素-8 等,在血小板存储过程中不断积累,在其活化后会参与TRALI等多种输血不良反应的发生。

血小板在TRALI 中的具体作用机制一直存在疑问。 目前的研究表明血小板对TRALI 的致病过程具有促进作用。 采用用大剂量阿司匹林或血小板膜糖蛋白(GP)IIb、IIIa 抑制剂,阻断血小板后能有效遏制肺的病理损伤和死亡。 对大鼠输注来自老化血小板的无细胞上清后能够诱发严重的TRALI[3-5]。 以上研究均说明来自血小板分泌的可溶性介质可能触发和推动了TRALI的发生。 存储的血液制品中的可溶性介质主要为具有生物活性的脂质,对存储5 d 后的血小板脂质成分分析发现鞘磷脂神经酰胺含量最为丰富,神经酰胺主要由鞘磷脂经酸性鞘磷脂酶在体内进行生物合成,是造成TRALI 的关键性物质[6]。 因此,本研究推测,储存后的血小板可能通过酸性鞘磷脂酶增加神经酰胺的形成而诱导抗体非依赖性TRALI 的发生。

为了检验这个假设,本研究首先LPS 预刺激小鼠后,输注含有酸性鞘磷脂酶特异性抑制剂ARC39或酸性鞘磷脂酶特异性基因缺失的老化血小板构建TRALI 的二次打击模型,分析血小板中的脂质成分和肺损伤程度,评估神经酰胺在血小板介导的TRALI 发病过程中的具体作用机制,现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选择近交系 8 ～10 周龄/雄性,SPF 级 BALB/c小鼠,共35 只[SCXK (川) 2018-0032],每只小鼠体重 22～30 g；以及 8 ～10 周龄,SPF 级酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,Asm)基因敲除小鼠,共35 只[SCXK (川) 2016-0030],每只小鼠体重 22 ～30 g。 所有实验动物由中南大学湘雅医学院大学实验动物中心提供和饲养[SYXK(湘)2018-0025]。实验前1 周所有动物饲养于实验动物中心SPF 级饲养间,小鼠饲料、饮水及垫料均经标准化消毒灭菌处理,自由饮水,12 h 昼夜节律。 所有动物实验内容符合中南大学湘雅医学院大学动物伦理和保护指南,实验经过本单位伦理审批(2018HK0342),全部实验内容遵循3R 原则。

1.2 主要试剂

LPS(货号:L2630)购自美国 sigma 公司；巨噬细胞炎性蛋白MIP-2 的ELISA 检测试剂盒(货号:MM200) 和 肿 瘤 坏 死 因 子-α (TNF-α) (货 号:MTA00B)购买自加拿大R&D 生物公司；凝血酶-抗凝血酶复合物 ELISA 检测试剂盒(货号:2013-1727)购买自上海广锐生物技术有限公司；髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性检测试剂盒(货号:ab144077)购买自美国Abcam 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 血小板的获取和存储

5 只雄性8 周龄BALB/c 小鼠及相同数量、性别、年龄的Asm基因缺失小鼠经麻醉后通过心脏穿刺收集全血标本,全血在室温下1200 r/min 离心15 min 三次后富集获得富含血小板血浆并对其中的血小板进行计数,再以无菌PBS 溶液将血小板浓度标化为终浓度每毫升1×109个,血小板存储液为10%柠檬酸-磷酸-葡萄糖-腺嘌呤混合而成的CPDA 缓冲液,其中一部分添加ASM 抑制剂ARC39(10 mol/L)后在无菌生物安全柜中存储。

1.3.2 小鼠TRALI 的二次打击模型构建及血小板输注

BALB/c 小鼠经腹腔注射2 mg/kg LPS 或等效体积的生理盐水,2 h 后经尾静脉缓慢注射10 mL/kg 剂量、浓度为每毫升 1×109个,存储 1 ～5 d 的BALB/c 小鼠血小板,或添加ASM 抑制剂ARC39 的BALB/c 小鼠血小板,或Asm基因缺失小鼠血小板,对照组输注相同体积生理盐水。 小鼠于室温下在笼子中观察6 h。

1.3.3 酶联免疫吸附试验( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测肺泡灌洗液中炎症介质表达水平。

处死小鼠后,进行气管插管,肺内注射1 mL 无菌 PBS 溶液后回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage, BALF),2000 r/min 离心 5 min 去除细胞获取上清得到 BALF,检测 BALF 中TNF-α、凝血酶-抗凝血酶复合物角和巨噬细胞炎症蛋白2(macrophage-inflammatory protein 2, MIP-2)水平,大致步骤如下:每孔加入50 μL 样品稀释液,然后分别加入相应的50 μL 标准品及各组小鼠样品,轻轻摇匀,封上膜后室温孵育2 h；配置好洗液并洗板5 次,将孔中的液体拍打干净之后,每孔加100 μL 生物素耦联抗体,再封上新膜后室温孵育2 h,洗板5 次,每孔加入100 μL 显色底物,室温避光孵育30 min 显色,每孔加入 100 μL 反应终止液,读取450 nm 和540 nm 的吸光度值。 根据标准品的浓度与OD 值做标准曲线,根据标准曲线拟合出方程,并计算得到相应的指标浓度。

1.3.4 肺组织MPO 活性定量检测

分别取各组小鼠的肺组织,在冰上使用匀浆器充分匀浆组织后10000 r/min 离心10 min,收集离心后上清,即为肺组织匀浆液。 依照试剂盒说明书的操作步骤测定组织匀浆液在480 nm 处的吸光度值,根据吸光度值计算不同肺组织的MPO 活性。

1.3.5 肺组织MPO 活性定量检测

输注血小板观察6 h 后颈椎脱臼法处死各组小鼠,取小鼠左肺组织进行湿/干重比值测定:将肺组织置于电子天平上称量总质量W1,随后置于70℃恒温烘干箱烘干72 h 使其水分完全蒸发。 再次称量干燥后的组织记录为W2。 计算时采用公式“(湿重)/(干重)×100%=(W1)/(W2)×100%”计算出数值。 取右肺组织进行石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色后,用树胶封固,放在温箱中烤干后,在光学显微镜下根据肺泡或间质中性粒细胞、透明膜、空隙碎片和肺泡间隔增厚等指标,使用组织学肺损伤评分对肺损伤进行分级。

1.3.6 血小板脂质谱成分分析

从储存后的血小板上清液中提取神经酰胺并采用液相色谱法进行定量测定,主要步骤如下:将冷冻后的血小板解冻并以3000 r/min 离心15 min,以四氯甲醇萃取收集脂质。 采用Q-TOF 6530 质谱仪(Agilent Technologies,Waldbron,德国)及串联质谱对鞘磷脂成分进行分析,使用Mass Hunter 软件(Agilent Technologies)进行量化处理。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 及Prism 7.01 (美国Graph Pad Software 公司)软件进行统计学分析,计量数据表示为“平均数±标准差()”,多组间比较采用单因素方差分析,以Dunnett 检验进行事后两两比较,P＜0.05 为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 伴随血小板存储时间的增加TRALI 肺损伤加剧

为了明确血小板储存时间对于TRALI 的影响,本研究对BALB/c 小鼠进行LPS 腹腔注射后,分别输注存储 0、1、3、5 d 的血小板。 6 h 后处死小鼠,观察小鼠肺发现,输注血小板后小鼠肺出现了严重的特征性损伤。 肺组织病理切片出现了明显的肺水肿和组织损伤。 湿/干肺重量比值在输注储存3、5 d血小板的小鼠中显著上调(图1A)。 BAL 蛋白含量在输注储存5 d 血小板的小鼠体内增加明显(图1A)。 肺 MPO 活性在输注储存 1、3、5 d 血小板的小鼠中均显著上调超过1 倍(图1A)。 HE 染色显示输注储存1、3、5 d 血小板的小鼠肺组织损伤加重(图1B)。 以上结果表明,输注老化的血小板会导致肺水肿形成、血管屏障衰竭、肺中性粒细胞浸润和肺组织病理学损伤；并且TRALI 的损伤程度与血小板储存时间呈现正相关。

2.2 神经酰胺随着存储时间的增加在小鼠血小板中的含量增加

为了明确是否由于血小板中神经酰胺可以随储存时间的增加而积累,本研究通过液相色谱-质谱对存储后的血小板样品中神经酰胺成分的定量分析显示:神经酰胺随着存储时间的延长在血小板中不断增加,存储第7 天的血小板中神经酰胺的含量是第 0 天的 1.6 ～ 2.9 倍(如图 2 所示)。 以上结果表明随着血小板储存时间的延长,神经酰胺会持续积累,从而加剧小鼠TRALI。

2.3 ASM 抑制或缺失后,老化血小板介导的TRALI 明显减弱

图1 老化的血小板输注到LPS 预刺激后的小鼠体内中会加剧TRALI 的组织病理损伤Note.A, Ratio of wet weight to dry weight of mice, the concentration of protein in BAL and the activity of MPO in lung tissue.B, Histopathological photos of HE staining of lung tissue after transfusion of platelets with different storage time.Compared with the normal control group, *P＜0.05.Compared with platelet storage group, #P＜0.05.Figure 1 The ratio of wet weight to dry weight, the concentration of protein in BAL and the activity of MPO in lung tissue of mice after transfusion of aged platelets into LPS pre-stimulated mice with different storage time of TRALI

图2 不同种类的神经酰胺随储存时间的增加在小鼠血小板中的积累Note.The contents of different kinds of ceramides in stored platelet samples were quantitatively analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS).Compared with the normal control group, *P＜0.05.Compared with platelet storage group, #P＜0.05.Figure 2 Accumulation of different kinds of ceramides in mouse platelets with the increase of storage time

为了进一步探讨鞘磷脂在老化血小板介导的TRALI 中的具体机制,本研究通过两种不同的途径阻断鞘磷脂的生成:药物抑制鞘磷脂形成(ASM 的抑制剂ARC39 预处理血小板)和输注Asm基因缺失小鼠来源的血小板。 我们观察到抑制或阻断鞘磷脂的生成后,肺MPO 活性和肺组织病理学损伤显著好转,湿/干肺重量比和 BAL 蛋白含量降低(图3A)。 HE 染色也显示小鼠肺在输注Asm基因缺失血小板或ARC39 预处理后的血小板后显著改善了肺损伤(图3B)。

3 讨论

通过本项研究,我们发现存储后的血小板中累计产生的神经酰胺是触发血小板介导的抗体非依赖性TRALI 的新机制,特异性的通过抑制ASM 活性减少神经酰胺的产生能够明显减轻TRALI 症状,潜在延长血小板的存储时间并增加输血的安全性,为临床血制品的存储开辟了新的前景。

血小板是一种临床稀缺的血液制品,因此常常需要尽可能延长其存储时间和最大限度的提高其临床利用率,但是长时间存储的血小板会增加TRALI 的风险[7]。 我们通过构建小鼠 TRALI 的二次打击模型,在输注血小板6 h 后即触发TRALI 的特征性临床表现:肺水肿形成、血管屏障衰竭、肺中性粒细胞积聚和肺组织学损伤,并且发现TRALI 病情的严重程度呈现血小板的储存时间的依赖性。既往的研究已经证明神经酰胺是内皮屏障失效和肺损伤的重要介质。 在肺组织和细胞中鞘脂类相关酶类的表达量非常高,当机体受到诸如肿瘤坏死因子-α 和血小板活化因子等刺激时,支气管肺泡灌洗液中酸性鞘磷脂酶的活性增高,神经酰胺量也相应增加。 并且ASMase 的活性与神经酰胺量的同步增加,而应用ASMase 抑制剂后,神经酰胺的生成显著减少,肺功能得到了改善[8-9]。 神经酰胺通过抑制内皮细胞一氧化氮合酶活性增加肺内皮细胞通透性,导致内皮细胞Ca2+内流以及内皮屏障破坏和肺水肿形成[10-12]。 此外,神经酰胺可以促进内皮细胞凋亡,从而进一步加重肺中的内皮屏障破坏[13-15]。 我们通过鞘磷脂成分分析发现在长时间存储的血小板中神经酰胺的含量增加最为显著,提示在TRALI 的致病过程中,神经酰胺可能发挥重要作用,进一步通过ASM 抑制剂或输注ASM 基因缺陷小鼠来源的血小板可以明显缓解TRALI 症状。因此,我们的动物实验成功证实神经酰胺可能是血小板介导的抗体非依赖性TRALI 的重要分子,而且靶向抑制ASM 依赖的神经酰胺的形成可以降低老化血小板介导ALI 的风险,从而增加储存血液制品的安全性。

图3 输注Asm 基因缺失小鼠来源的血小板或ASM 特异性抑制剂处理后的储存血小板可明显减弱减弱TRALI 损伤Note.A.Ratio of lung wet weight to dry weight, the protein concentration in BAL and the activity of MPO in lung tissue of each group of mice were marked as shown in the figure.B, HE staining tissue sections of the lungs of each group of mice。 Compared with the normal control group, *P＜0.05.Compared with platelet transfusion group, #P＜0.05.Figure 3 Transfusion of platelets derived from Asm gene deleted mice or stored platelets treated with ASM specific inhibitors could significantly attenuate TRALI damage

在早期研究中,通过输注针对小鼠血小板的兔多克隆血清耗竭血小板或者高剂量阿司匹林可以有效遏制TRALI 的发生发展。 我们前期实验发现:这种高剂量的阿司匹林仅能降低TRALI 小鼠的死亡率,而在药理学剂量(10 mg/Kg)下并没有观察到保护作用。 鉴于阿司匹林对COX-1 有抑制作用,这表明大剂量阿司匹林的保护作用可能源于其血小板非依赖性的抗炎和抗氧化特性,或来自代谢衍生物水杨酸盐的特性,而不是其抗血小板活性。 此外,临床上血小板常规的存储时间为3 ～5 d,在美国基于预防细菌污染的考虑,血小板存储时间限定在5 d 以内[16]。 在本研究中,靶向抑制 ASM 活性,不仅能够缓解输注存储5 d 的血小板之后的TRALI 症状,并且可成功将小鼠血小板的储存时间延长至7 d,有助于提高临床血小板使用率,缓解血制品的供需矛盾。