实验小鼠感染诺如病毒后组织病理变化及病毒含量分析

李晓波付 瑞王 吉王淑菁王莎莎李 威秦 骁黄宗文贺争鸣岳秉飞

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,北京 102629)

自小鼠诺如病毒(murine norovirus, MNV)2003年由Karst 等人[1]发现以来,世界各地的报道表明其在实验小鼠中有很高的感染率,并且各品系小鼠均对其易感[2-5],免疫功能正常的小鼠感染MNV 后大多无明显临床症状,但可持续通过粪便排毒长达数月[6],表明MNV 可在小鼠体内长期存在,易造成实验小鼠中的广泛传播。 国际上一些实验动物权威监管和检测机构已将其列为实验小鼠需要常规监测的病原体[7]。

MNV 感染致小鼠组织发生病理损伤的报道多集中在小鼠肠道疾病模型及免疫缺陷鼠,MNV 感染在不同的小鼠模型试验中产生的临床症状不相同,有的严重,有的几乎观察不到。 同样,不同的小鼠实验造成的组织损伤也有所不同,损伤的严重程度除了与不同的疾病模型有关,还与所用病毒的毒株、感染时间、病毒接种途径及其他实验条件相关[8]。

已报道的发现病理损伤的组织最常见的是肝、其他还见于肺、脾、胃肠道及肠系膜淋巴结等[8],目前MNV 感染免疫功能正常小鼠病理损伤研究较少,所研究的品系有限,主要为129 小鼠[1,9-12]。

本文通过对实验常用的KM,BALB/c,C57BL/6,NIH,BALB/c-nu 等品系的小鼠人工感染MNV,研究感染后不同的时间点各组织脏器的病理改变及核酸含量变化情况,探讨MNV 感染对小鼠实验可能存在的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

5 个品系SPF 级小鼠,分别为KM,BALB/c,NIH,C57BL/6 及BALB/c-nu,均为6 周龄,体重分别为KM 30～32 g,BALB/c 18～20 g,NIH 20 ～22 g,C57BL/6 16 ～18 g,BALB/c-nu 16 ～18 g,每个品系50 只,雌性,购自国家啮齿类实验动物种子中心[SCXK(京)2017-0005],经检测符合SPF 等级实验动物国家标准且MNV 为阴性。 动物实验于中国食品药品检定研究院屏障动物设施进行[SYXK(京)2017-0013],实验所用鼠料、水及垫料等均经灭菌处理,已通过中国食品药品检定研究院实验动物福利伦理审查委员会审查(中检动(福)第2018(B)020 号),按实验动物的3R 原则给予人道关怀。

1.1.2 病毒株

小鼠诺如病毒 BJ10 - 2062 株(GenBank:KM458057),本实验室分离并保存[13],TCID50为10-4.625/0.1 mL。

1.2 主要试剂与仪器

甲醛溶液(批号:20180104)购自国药化学试剂公司；红细胞裂解液(批号:R7218)购自天根生物；TaqMan Gene Expression Master Mix(批号:00701838)购自ABI 公司；RNeasy Mini Kit(批号:157034469)购自Qiagen 公司；逆转录试剂(批号:0000310558)购自Promega；TB Green Premix Ex Taq GC、dNTP、无RNA酶水等购自TaKaRa。 荧光PCR 仪(ABI 7500 Fast)；生物组织包埋机(慧达HD-310)；切片机(MICROM HM315)；全自动染色机(Leica autostainer XL)；光学显微镜(OLYMPUS BX51)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及处理

每个品系的动物随机分为感染组和对照组,每组各25 只,参考文献报道的剂量[10-11],感染组经口灌胃0.2 mL MNV 病毒液(TCID50= 10-4.625/0.1 mL),对照组灌胃0.2 mL 生理盐水。 每日观察动物状态,分别在感染MNV 后第7,14,21,28,55 天于对照组和感染组各选取5 只小鼠,二氧化碳麻醉后取抗凝血,处死后立即取肝、脾、肺、小肠、盲肠、结肠等组织,每个组织取2 份,一份加入3 倍体积10%甲醛溶液固定,进行组织病理学诊断；另外一份组织取100 mg 加入900 μL 灭菌PBS,匀浆机充分匀浆,12000 r/min 离心5 min,取200 μL 上清进行组织核酸的提取。 取200 μL 抗凝血加入600 μL 红细胞裂解液,颠倒混匀,室温放置5 min,10000 r/min 离心1 min,吸去上清,余下沉淀加入200 μL 灭菌PBS,重悬后提取核酸。

1.3.2 病理学诊断:

步骤1.3.1 所取组织在甲醛溶液中固定1 周,每48 h 换一次固定液,后经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE 染色等步骤制备病理切片,在光学显微镜下进行观察并采集数码图像。

1.3.3 组织MNV 核酸含量测定

步骤1.3.1 所取组织,匀浆机充分匀浆,12000 r/min 离心5 min,取200 μL 上清液提取RNA,先将提取的RNA 逆转录为cDNA,逆转录体系包含5×RT buffer 5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)4 μL,随机引物1 μL,逆转录酶0.5 μL,RNA 模板8 μL,去RNA 酶水6.5 μL。 反应条件:37℃90 min,72℃15 min,4℃5 min。 按参考文献[14]报道的荧光定量PCR 法测定MNV 核酸含量,20 μL 的反应体系包含TB Green Premix Ex Taq GC(2×)10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ROX reference dye II(50×)0.4 μL,待检cDNA 2 μL,无RNA 酶水6.8 μL。 反应条件为95℃预变性30 s；95℃10 s,60℃30 s,共40 个循环,每个循环结束采集荧光信号。 每次扩增设阳性对照和阴性对照,质粒标准品由TaKaRa 合成,设5 个浓度,分别为1.1×103～1.1×107copies/μL,每个浓度做3 个平行,最后通过标准曲线进行定量。

1.3.4 结果分析

(1)比较各组织总的病理变化及核酸检测情况。

(2)比较不同品系小鼠之间各组织病理改变情况及核酸含量。

(3)比较小鼠感染MNV 后不同时间各组织病理变化及核酸含量变化特点。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 病理改变分析

2.1.1 不同组织病理改变分析

从发生病理改变的组织分布来看,感染组中肝、脾、肺均发现有不同程度的病理改变,其中肝病变率最高,为8%(10/125),主要表现为血管边缘大量胞核圆形碱性蓝染的淋巴样细胞聚集,伴有胞核杆状的纤维细胞增生；管腔壁增厚,胞核扁平或三角状的枯否氏细胞增多(图1)。 脾病变率为5.6%(7/125),主要表现为脾小结数量减少(图2)；肺病变率为4%(5/125),主要表现为肺细支气管旁边有较多的嗜碱性蓝染的淋巴样细胞浸润(图3),小肠、盲肠和结肠未发现病理变化(表1)。 对照组小鼠各组织均未发现病理改变。

2.1.2 不同品系动物病理改变分析

同一组织在不同品系小鼠的病理变化相似。KM 小鼠病变主要发生在肝和肺,发生率均为12%(3/25),脾为4%(1/25)；BALB/c 小鼠肝、脾和肺均发生病变的发生率仅为4%(1/25)；C57BL/6 小鼠发生病变的部位主要是肝和肺,病变率分别为8%(2/25)和4%(1/25),脾未发现病变；NIH 小鼠发生病变的组织集中在肝和脾,发生率均为12%(3/25),肺未发现病变；BALB/c-nu 小鼠肝和脾有病变发生,发生率分别为4%(1/25)和8%(2/25)。所有品系小鼠的肠道组织(盲肠、结肠和小肠)均未发现病理改变(表1)。

图1 肝病理变化Note.A/B, Control group.C/D, Infection group.Figure 1 Pathological changes of liver

图2 脾病理变化Note.A/B, Control group.C/D, Infection group.Figure 2 Pathological changes of spleen

图3 肺病理变化Note.A/B, Control group.C/D, Infection group.Figure 3 Pathological changes of lung

2.1.3 感染MNV 不同时间病理改变分析

从病变发生的时间看,在感染MNV 第7 天,KM小鼠肝和肺各出现1 例病变；NIH 小鼠有1 例脾的脾小结数量减少；感染第14 天,KM 小鼠和NIH 小鼠各有1 例肝发生病变,BALB/c、NIH 及BALB/cnu 小鼠各有1 例脾发生病变；感染第21 天,KM、BALB/c、NIH 及BALB/c-nu 小鼠各有1 例肝病变,同时BALB/c 小鼠肺1 例,NIH 小鼠脾1 例发现病变；感染第28 天,KM 小鼠有2 例肺出现病变,NIH小鼠1 例肝,C57BL/6 小鼠1 例肺,BALB/c-nu 小鼠1 例脾发现病变。 感染第55 天,KM 小鼠1 例脾、C57BL/6 小鼠2 例肝发现病变,其余各品系无明显病变。 综上分析,KM 及NIH 小鼠发生病变较早,其次为BALB/c 和BALB/c-nu 小鼠,而C57BL/6 小鼠产生病变的时间较晚。

2.2 组织核酸的检测

2.2.1 不同组织核酸的检测

总体来看,盲肠、结肠MNV 核酸阳性率均为100%(125/125),其次为小肠,阳性率为71.2%(89/125)；各脏器中脾的阳性率最高,为39.2%(49/125)；肝阳性率为17.6%(22/125),肺的阳性率为3.2%(4/125),有2 份血样检出核酸阳性(2/125)。 阳性组织核酸含量相比,肠道含量较高,其中盲肠含量最高,其次为结肠及小肠；脏器含量较低,依次为脾＞肺＞肝。 对照组所有组织MNV 核酸均为阴性。

2.2.2 不同品系小鼠核酸含量的比较

比较不同品系小鼠各阳性组织MNV 核酸含量,各品系小鼠肝、脾、小肠、盲肠核酸含量无统计学差异；BALB/c-nu 小鼠结肠核酸含量显著高于其他品系小鼠(P＜0.01)(表2)。

2.2.3 感染MNV 不同时间各品系组织核酸含量比较

经单因素方差分析,C57BL/6 小鼠感染MNV第14 天盲肠MNV 核酸含量显著高于其他时间(P＜0.05),第7、14 天结肠含量极显著高于第28、55 天(P＜0.01)。 其余品系小鼠各组织MNV 核酸含量各个时间点之间无显著差异(图4)。

2.2.4 组织病变与MNV 核酸检出率的关系

各组织病理与核酸检测的结果统计见表3,结果表明405 份组织样本病理检查为阴性,而核酸检测结果为阳性；13 份样品病理检查结果为阳性而核酸检测结果为阴性,说明病理检查与核酸检测结果并不一致,两者无相关性。

表1 感染组各组织病理及核酸检测结果Table 1 Pathology and nucleic acid test results of infection groups

表2 不同品系小鼠各组织核酸含量(,copies/mg)Table 2 Nucleic acid content of different tissues

表2 不同品系小鼠各组织核酸含量(,copies/mg)Table 2 Nucleic acid content of different tissues

注:与其他品系比较,*P＜0.01。Note.Compared with other strains, *P＜0.01.

品系Strains肝脾Liver Lung盲肠Cecum结肠Colon小肠Small intestine KM 6.2±1.3 49.7±12.5 6510.6±788.9 1189.2±457.3 1985.4±139.8 BALB/c 3.7±0.9 40.1±10.9 7571.6±695.4 2355.4±583.7 1245.9±152.3 C57BL/6 4.0±1.2 44.9±8.9 7881.8±865.9 2291.1±614.1 1872.2±168.5 NIH 6.1±1.2 39.0±5.3 5864.0±588.0 1965.8±763.7 1031.8±111.2 BALB/c-nu 4.6±1.3 37.8±7.0 6462.7±653.1 9370.0±894.4* 1238.9±105.9

图4 C57BL/6 小鼠感染MNV 不同时间盲肠和结肠核酸含量变化Note.A, Cecum.B, Colon.Compared with other time points, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 4 Nucleic acid contents in cecum and colon at different days post MNV infection of C57BL/6 mice

表3 各组织病理检查与核酸检测结果比较Table 3 Comparison of pathological examination and nucleic acid test results

3 讨论

本文针对MNV 感染国内常用的五个品系(包括封闭群和近交系)实验小鼠引起的组织病理改变情况进行了初步的研究,结果发现所有感染组小鼠中肝病变率最高,达8%,主要表现为血管周围淋巴细胞浸润；其次为脾,病变率为5.6%,主要表现为脾小结数量的减少,脾小结位于脾白髓中央动脉周围淋巴鞘的旁侧,为B 细胞区,脾小结数量减少意味着淋巴细胞数量的减少,动物免疫力的降低,由于MNV 对小鼠巨噬细胞、树突状细胞和B 细胞具有感染亲嗜性[15-16],而这些细胞与动物的免疫功能密切相关,表明MNV 感染会影响动物的免疫系统,这在我们前面的研究中得到了证实[17]；肺的病变率为4%,主要表现为支气管周围的淋巴细胞浸润；出乎意料的是,虽然MNV 是肠道病原体,但本研究所有动物均未发现存在盲肠、结肠及小肠(主要为十二指肠)的病变,推测MNV 已经很好的适应了宿主的免疫系统,因而不引起或只引起轻微的肠道病变[8,12,18]。 最初的研究发现免疫缺陷小鼠(STAT1-/-/IFNγR-/-)感染MNV 后容易造成较严重的组织损伤,如可造成肝和脾的炎症反应,组织细胞坏死及肺和肠组织的炎性损伤,并引起全身性的组织病变[1],而本研究小鼠病理改变大多较轻微,表明固有免疫在防御MNV 感染中发挥着重要作用。 BALB/c-nu 小鼠发生的病理改变并未明显高于其他品系小鼠,说明胸腺依赖的T 细胞免疫在MNV感染过程发挥的作用较轻微。

本研究通过检测MNV 核酸来间接反映各组织中病毒的含量,从结果来看,除了肺,其余各组织核酸阳性率远远高于病理改变阳性率,其中盲肠和结肠核酸阳性率均为100%,其次为小肠,脏器组织核酸阳性率较低,其中肺最低,我们在2 份血样中检测到了核酸,表明病毒感染有可能引起动物的病毒血症。 从核酸含量来看,基本与核酸阳性率成正相关,各组织核酸含量由高到低依次为:盲肠＞结肠＞小肠＞脾＞肺＞肝；各品系相比,除了BALB/c-nu 小鼠结肠含量显著高于其他品系,其余均无统计学差异；分析核酸含量随感染MNV 的时间变化情况发现,C57BL/6 小鼠盲肠与结肠的含量均在感染后第14 天显著高于其他时间点,达到高峰,其余品系各组织的变化均未发现统计学差异。 我们分析了病理检测与核酸检测的结果,发现两者并不一致,即病理改变阴性的样本核酸检测不一定为阴性,这一发现与已有研究相似[19],推测可能的原因:病理改变的发生是动物机体抗病毒免疫应答的结果,通过免疫应答来清除组织中的病毒,同时造成了组织本身的炎性病理损伤,而病毒也会通过免疫逃逸机制来拮抗机体的免疫应答,最后动物的抗病毒免疫与病毒的拮抗之间达到平衡,病理损伤可随着时间修复,而病毒仍存在于组织中,从而造成观察到的病理改变的发生率远远低于病毒阳性率。