C57BL/6J、BALB/c、ICR 品系小鼠学习记忆能力的行为学差异

李祥磊孙秀萍

(北京协和医学院比较医学中心,中国医学科学院医学实验动物研究所,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,国家中医药管理局人类动物模型三级实验室,北京 100021)

基于体积小,生殖周期短,易观察且基因组与人类基因组高度同源等优势,实验小鼠是复制人类疾病和研究基因功能的首选动物模型[1]。 在生命科学,尤其是基础医学、制药等研究领域广泛应用[2-4]。 实验小鼠在培育过程中已分为多个品系,根据基因纯合程度,可分为近交系、封闭群、杂交群三类[5]。 C57BL/6J、BALB/c 小鼠属于近交系,ICR小鼠属于封闭群,这三个品系小鼠在神经精神等各类疾病模型中广泛应用[6]。 不同品系的小鼠,由于遗传背景等差异,其生物学特点和行为表型差异也较大[7],导致在同一模型的建立中敏感度不同,三个品系小鼠在学习记忆能力方面研究数据又较少。故本文对这三个品系小鼠学习记忆的本底行为进行研究,以期为神经精神疾病动物模型的品系选择提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

10 周龄体重 25 ～ 30 g SPF 级雄性 C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠各10 只,购于北京华阜康科技股份有限公司[SCXK(京) 2019-0008]。 实验在中国医学科学院医学实验动物研究所行为学分析平台进行[SYXK(京) 2018-0019],实验经本单位动物伦理批准(QC18006),实验动物的使用依据3R 原则给予人道的关怀,动物设施室内温度23℃～25℃,相对湿度55%±10%。 维持12 h 光照/12 h 黑暗的昼夜节律。

1.2 主要仪器

EthoVision XT9(Noldus,荷兰)；条件恐惧实验系统(MED,美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠按品系分为 3 组,每组10 只。 开始实验前将动物放入检测间适应1 h,实验在 9 ∶00 ～ 17 ∶00 之间进行,每轮实验后均需清除仪器内残留气味,使用75%乙醇擦拭检测仪器。

1.3.2 旷场实验

旷场为边长50 cm,高30 cm 正方体开口测试箱,测试箱顶部安装摄像头,监测动物的活动状态并将动物的行为信息采集传输至计算机系统,图像采集分析系统为EthoVision XT 9。 测试箱分为中央区、过渡区、边缘区三个区域,中央区中心点为动物投放点,每只小鼠在测试箱内自由探索,记录小鼠5 min 内的移动距离、速度、中央区移动距离百分比、中央区停留时间、大运动(速度大于6.6 cm/s)移动距离及小运动(速度介于2.2 cm/s ～6.6 cm/s 之间)移动距离。

1.3.3 Barnes 迷宫实验

Barnes 迷宫为直径88 cm 圆盘,为避免灯光反射,设置为哑光材质,圆盘上有等距分布在圆盘边缘的12 个直径5 cm 圆洞,圆盘下固定逃避盒,规格为15 cm×6 cm×6 cm(长×宽×高),起始盒规格为10 cm×10 cm。 实验图像记录分析软件为EthoVision XT 9。 实验时伴有噪音刺激(噪音录音,80 db)和强光刺激(直射灯,250 lux)。 在Barnes 迷宫周围放置几何空间标记物,方便小鼠空间定位,检测间人员位置与物品摆放位置不变。 实验分为适应期、学习期和测试期。 适应期,在迷宫中心放置实验小鼠,扣上起始盒10 s 后,开启噪音,随之撤掉起始盒,人为干预引导小鼠行动路径,进入目标洞后,立即关闭噪音。 小鼠在逃避盒适应3 min 后取出,适应期为1 d；学习期,在迷宫中心放置实验小鼠,扣上起始盒10 s 后开启噪音,随之撤掉起始盒,开始实验。每只实验小鼠一次训练3 min,一天训练3 次,共4 d。 3 min 内小鼠进入目标洞,程序停止,看作训练成功,小鼠从起始盒到进入目标洞时间为潜伏期(latency),如若3 min 内没有进入目标洞,潜伏期为3 min。 无论是否训练成功,均需将实验小鼠放置在逃避盒里,适应环境1 min；测试期,撤除逃避盒,实验小鼠测试1 次,时间为1.5 min,操作方法同学习阶段,共测试1 d,记录目标洞潜伏期和停留时间。

1.3.4 Y 迷宫实验

Y 迷宫规格为30 cm×8 cm×15 cm(长×宽×高)的三个长方体拼接而成,角度互为120°,背景为白色。 图像采集分析系统为EthoVision XT 9。 Y 迷宫基于动物喜爱探索新环境的特性而设计,在迷宫内贴有3 个不同颜色,形状标记物,帮助小鼠进行空间定位,检测间人员位置与物品摆放位置不变。

自发性交替实验实验周期为1 d,将小鼠面壁放入起始区,时间为5 min,记录小鼠探索轨迹。 小鼠在Y 迷宫中,倾向于交替探索三个不同臂(分为A、B、C 三个臂),例如 ABC,ACB,BAC,BCA,CAB,CBA 等作为实际转换次数(alternation),BCB、ACA、BAB 等不计入,探索进臂总次数减两次作为最大转换数。 并计算转换率=[正确交替反应次数/(N-2)]×100%。

新异臂探索实验一周后进行新异臂探索实验。将Y 迷宫三个臂分别命名为起始臂(start)、新异臂(novel)、其他臂(other)。 该实验分为训练期和测试期。 训练期将新异臂用隔板挡住,将小鼠放入起始臂,在起始臂和其他臂中自由活动5 min,训练结束后归笼。 15 min 后进行测试期实验。 测试期将新异臂挡板抽离,将小鼠放置起始臂,在三个臂中自由活动5 min,记录每只小鼠在各个臂停留时间和次数。

1.3.5 条件恐惧实验

实验硬件由测试箱,控制器,电击与声音装置构成,计算机,红外摄像头。 实验周期为4 d,适应期1 d,测试箱内放入实验小鼠,适应10 min,不给予电击和声音刺激,学习期1 d,适应3 min,确定三个品系小鼠之间的基线。 后对小鼠训练5 个循环,每个训练包括声音刺激(70 db,5000 Hz,30 s,条件性刺激)以及最后1 s 电击刺激(0.5 mA,1 s,非条件性刺激),每轮训练间隔30 s ～60 s,训练结束30 s 后取出实验小鼠；场景性条件恐惧实验1 d,不给予电击和声音刺激,将小鼠放入测试箱5 min,结束后让小鼠在箱内停留30 s；线索性条件恐惧实验1 d,改变测试箱气味与环境条件,只给予声音刺激,操作方法同训练期。 统计三个阶段实验小鼠的僵直时间。 僵直是啮齿类动物的一种防御行为,通常呈现出较为刻板的蹲伏及摇摆,除正常呼吸外没有其他肌肉活动,表达动物的恐惧行为[8]。 除实验动物正常呼吸外,所处静止状态的时间,是僵直时间判断的标准,它表明小鼠对条件恐惧刺激的记忆程度[9]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行分析。 实验结果以平均数±标准误差()形式表示。 采用单因素方差分析进行多组间比较,当多组间有差异时,两两比较采用Fisher’s LSD post hoc 多重比较方法。P＜0.05 认为具有统计学显著性差异。

2 结果

2.1 C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠旷场实验数据比较

如图1、2 所示,C57BL/6J 组小鼠移动距离与速度少于ICR 组小鼠和BALB/c 组小鼠,差异具有统计学意义(P＜0.01、P＜0.05),ICR 组和BALB/c组小鼠差异无统计学意义；如图3 所示,C57BL/6J 组小鼠大运动移动距离少于ICR 组小鼠,差异具有统计学意义(P＜0.01),C57BL/6J 组小鼠大运动移动距离少于BALB/c 组小鼠,差异具有统计学意义(P＜0.01),ICR 组和BALB/c组小鼠,但差异无统计学意义；如图4 所示,C57BL/6J 组小鼠小运动移动距离多于ICR 组小鼠和BALB/c 组小鼠,差异具有统计学意义(P＜0.01、P＜0.01),ICR 组和BALB/c组小鼠差异无统计学意义。 如图5 所示,C57BL/6J组小鼠在中央区移动距离百分比最小、ICR 组小鼠其次,BALB/c 组小鼠最大,三组小鼠两两比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)；如图6 所示,C57BL/6J 组小鼠在中央区停留时间少于BALB/c 组小鼠,差异具有统计学意义(P＜0.01),ICR 组小鼠在中央区停留时间少于BALB/c 组小鼠,差异具有统计学意义(P＜0.01),C57BL/6J 和ICR 组小鼠差异无统计学意义。

2.2 C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠 Barnes 迷宫实验数据比较

图 1 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在旷场实验运动距离的表现Note.C57BL/6J group compared with ICR group, ** P ＜0.01,* P＜0.05.C57BL/6J group compared with BALB/c group,## P＜0.01, # P＜0.05.ICR group compared with BALB/c group,$$ P＜0.01, $P＜0.05.The same as below.Figure 1 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in the open field experiment

图 2 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在旷场实验大运动距离的表现Figure 2 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in large range of movement in an open field experiment

图 3 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在旷场实验小运动距离的表现Figure 3 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in small distance of movement in an open field experiment

图 4 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在旷场实验运动速度的表现Figure 4 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in the field experiment

图 5 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在旷场实验中央区运动距离占总距离的百分比的表现Figure 5 The performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in the percentage of the total distance in the central area of the open field experiment

图 6 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在旷场实验中央区停留时间的表现Figure 6 Residence time of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in the central area of the empty field experiment

如图7 所示,在学习期,C57BL/6J 组小鼠进洞潜伏期最短,其次是ICR 组小鼠,BALB/c 组小鼠最长,三组小鼠第1 天与第3 天进洞潜伏期差异无统计学意义,第2 天与第4 天进洞潜伏期差异具有统计学意义(P＜0.05)；如图 8 所示,在测试期,C57BL/6J 组小鼠在目标区探索时间多于ICR 组小鼠,差异无统计学意义,C57BL/6J 组小鼠在目标区探索时间多于

BALB/c 组小鼠,差异具有统计学意义(P＜0.01),ICR组小鼠在目标区探索时间多于BALB/c 组小鼠,但差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠 Y 迷宫实验数据比较

如图9、图10 和图11 所示,三组小鼠在自发转换率,进臂停留时间与次数等实验数据差异均无统计学意义。

图 7 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在 Barnes迷宫实验进洞潜伏期的表现Figure 7 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in Barnes maze experiment during burrow incubation period

图 8 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在 Barnes 迷宫实验目标去探索时间的表现Figure 8 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice during Barnes maze experiment

图 9 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在 Y 迷宫自发性交替实验转换率的表现Figure 9 Spontaneous alternation rates of C57BL/6J,ICR, and BALB/c mice in the Y maze spontaneous alternating experiment

2.4 C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠条件恐惧实验数据比较

如图12 所示为学习期前的适应期,图中僵直时间,作为三组小鼠的基线,差异无统计学意义；如图13、图14 和图15 所示,三组小鼠在条件恐惧实验学习期、场景性条件恐惧和线索性条件恐惧僵直时间,差异均无统计学意义。

图 10 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在 Y 迷宫新异臂探索实验进臂停留时间的表现Figure 10 Time in arm visitss of C57BL/6J, ICR,and BALB/c mice in the Y maze experiment

图 11 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在 Y 迷宫新异臂探索实验进臂次数的表现Figure 11 The performance of C57BL/6J, ICR,and BALB/c mice in the experiment of Y maze new different arm exploration

图 12 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在条件恐惧实验学习期的僵直时间基线Figure 12 Rigid time baseline of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice during conditioned fear experimental learning period

图 13 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在条件恐惧学习期的僵直时间表现Figure 13 Frezzing time of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice during conditioned fear learning period

图 14 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在场景性条件恐惧实验的僵直时间表现Figure 14 Frezzing time performance of C57BL/6J, ICR,and BALB/c mice in the contextual fear conditioning experiment

图 15 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在线索性条件恐惧实验的僵直时间表现Figure 15 Frezzing time performance of C57BL/6J, ICR,and BALB/c mice in the cued fear conditioning experiment

3 讨论

旷场实验因其操作相对简单、应激刺激小的特点,用于检测动物自发活动以及焦虑水平,在神经精神疾病和神经精神药理方面应用最多[10]。 本实验结果表明,C57BL/6J 小鼠运动距离、运动速度及运动时间均显著低于其他两组小鼠,说明其自发活动低于ICR 与BALB/c 小鼠。 基于啮齿类动物的趋触性,将实验区域分为边缘区和中央区,发现C57BL/6J 小鼠中央区运动距离与中央区时间均显著低于ICR 与BALB/c 小鼠,说明在旷场实验中其焦虑水平高于ICR 与BALB/c 小鼠,与李腾飞实验结果一致[11]。 但也与另一些文献[12-13]报道不一致。 可能与行为学测试方法不同等有关。 需要结合高架十字迷宫实验、埋珠实验等进行进一步分析。 每一种行为学检测方法都需要实验动物进行运动,旷场实验虽然不能测试小鼠学习记忆能力,但可以测试小鼠的运动能力是否正常,以免影响后续实验结果。

1979 年美国学者 Carol A Barnes 发明 Barnes 迷宫实验,用于检测海马依赖的空间参考记忆[14]。 与水迷宫实验利用啮齿类动物惧怕水的特性不同,Barnes 迷宫利用啮齿类动物爱探索且避光的特性而设计,对动物应激刺激较小。 实验不需要水源,将动物放在空旷的Barnes 迷宫中央,通过使用躁声与强光作为刺激手段,促使动物寻找目标洞。 学习期结果表示,C57BL/6J 小鼠在进洞潜伏期方面优于ICR 小鼠和BALB/c 小鼠；测试期结果表示,C57BL/6J 小鼠在目标区停留时间方面优于ICR 小鼠和BALB/c 小鼠。 综合结果,C57BL/6J 小鼠展示出的空间参考记忆能力优于ICR 小鼠和BALB/c 小鼠。与刘雪芹等的[15]水迷宫测试结果一致。

Y 迷宫由Dellu 等发明,针对啮齿类动物,Y 迷宫自发性交替实验研究空间工作记忆能力,利用啮齿类动物喜爱探索新环境,动物每次转换探索方向时都要记住前一次探索的方向,而下一次就会探索另一方向[16]。 自发性交替转换率越高,说明动物的工作记忆能力越强。 Y 迷宫新异臂探索实验研究空间识别记忆能力,同样利用啮齿类动物喜爱探索新环境,倾向于探索新异臂的偏好。 对新异臂探索时间越长,次数越多,说明动物的空间识别记忆能力越强。 实验中三组小鼠在自发性交替实验的转换率,没有显著性差异,提示三组小鼠在空间工作记忆没有显著性差异；新异臂探索实验中,进入各臂的次数与时间上均没有显著差异,表明在空间识别记忆能力上三组小鼠没有显著性差异。

条件性恐惧实验三组小鼠僵直时间的基线没有显著差异；三组小鼠在学习阶段、场景性条件恐惧测试和线索性恐惧测试中,僵直时间均没有显著性差异,三个测试阶段没有显著差异,提示三组小鼠在条件性恐惧记忆的生成没有显著差异性。

本研究比较了三个品系小鼠焦虑水平、空间参考记忆能力、空间工作记忆能力以及条件性恐惧记忆能力。 丰富了实验小鼠的生物学特性数据,对动物实验中小鼠品系选择提供参考依据；尤其为神经精神疾病动物模型的品系选择提供数据支撑。