MPTP 诱导C57BL/6 小鼠帕金森模型的制备和评估

林 臻陈洪志赵 航刘 辉许妍妍刘海岩张 浩

(吉林大学基础医学院人体解剖学系,长春 130021)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的中老年神经退行性病变,随着人口老龄化的加剧,患病人口日益增加[1]。 其病理学表现为中脑纹状体和黑质区域多巴胺能神经元进行性减少。 现有多种机理的动物模型可以模拟帕金森病的发生和进展,其中药物诱发化学损毁模型以其简便、快捷和较为经济的优势,成为广泛应用的模型制备方法。 1-甲基-4 苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)经腹腔注射后可造成小鼠黑质和纹状体区域多巴胺能神经元死亡,酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞和神经纤维减少,能够模拟帕金森病的病理学表现,是一种常见的帕金森病模型诱导药物[2]。 本研究拟通过对多种行为学表现的统计和评价,以及将行为学和形态学数据相互印证,初步建立一个可以通过行为学数据评估小鼠帕金森模型效果的简便途径。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性 C57BL/6 小鼠 35 只,年龄 3 ～ 9 月龄,体重25～26 g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司[SCXK(辽)2015-0001]。 饲养于吉林大学(基础医学院动物实验中心)[SYXK(吉)2018-0001]。本实验通过吉林大学基础医学院实验动物伦理审查((2016 年)研审第 001 号),依据优化、减少、替代的3R 原则进行实验设计。

1.2 主要试剂与仪器

MPTP 购自 Sigma 公司(货号:MO896,中国)；亚克力材质行为学评估水箱、支架、旷场环境,由吉林大学人体解剖学系自行制作。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的制作

雄性C57BL/6 小鼠35 只随机分为4 组,Ⅰ组为对照组5 只,给予计量为30 mg/kg 体重生理盐水,持续7 d。 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组为模型组,每组 10 只,分别给予计量为 35 mg/kg、30 mg/kg、25 mg/kg 体重的 MPTP 持续 7 d、8 d、10 d。

1.3.2 行为学检测

(1)震颤麻痹评分

小鼠采用腹腔注射给药,立即进行观察,持续3 h。 评分标准为:0 分,与正常小鼠相似,无任何症状；1 分,出现竖毛、弓背、间断性细小震颤,但活动自如；2 分,出现吞咽频繁,频繁性震颤,后肢张开,颤尾,活动逐渐受限；3 分,出现流涎、持续性震颤,四肢僵硬,活动受限；4 分,因全身麻痹而死亡。

(2)旷场实验

给药结束后第3 天开始,每天进行一次实验,持续到第7 天。 采用亚克力材质50 cm×50 cm×50 cm方盒作为场地,均匀划分为9 格,将小鼠放入旷场的正中格内,记录小鼠三爪以上跨入邻格的次数,观察持续2 min。 评分标准为:0 分,跨入次数＞40 次；1 分,跨入次数为 31 ～ 40 次；2 分,跨入次数为 21 ～30 次；3 分,跨入次数＜21 次。

(3)爬杆实验

给药前3 d,每天进行一次爬杆训练。 给药结束后第3 天开始,每天一次测量,持续到第7 天。 将一直径为2.5 cm 的塑料球固定于长50 cm、粗1.5 cm的亚克力杆顶端,缠上纱布以防打滑,然后将被测小鼠置于球上,记录由球上爬至杆子底部所需时间。 评分标准为:0 分,爬杆时间＜4.01 s；1 分,爬杆时间为 4.01～8.0 s；2 分,爬杆时间为8.01～12.0 s；3 分,爬杆时间＞12.00 s。

(4)悬挂实验

给药结束后第3 天开始,每天进行一次实验,持续到第7 天。 被测小鼠倒置悬挂,将两前爪置于30 cm 长,25 cm 高水平电线中点,而后放开小鼠,记录其抓握情况。 评分标准为,0 分,两后爪均可抓住电线；1 分,一只后爪可抓住电线；2 分,两只后爪均不能抓住电线。 如出现后爪反复抓取电线,间断可抓住现象,可记为0.5 分。

(5)游泳实验

给药结束后第3 天开始,每天进行一次实验,持续到第7 天。 小鼠放于40 cm×25 cm×16 cm 的水箱中,水深15 cm,水温为(27±2)℃,记录 3 min 内小鼠的漂浮时间。 评分标准为:0 分,漂浮 0 ～30 s；1分,漂浮 31 ～ 90 s；2 分,漂浮 91 ～150 s；3 分,漂浮151～180 s。

1.3.3 形态学检测

全部行为学测试结束后第1 天,将小鼠麻醉后,37℃ 80 mL 生理盐水灌流,4℃ 100 mL 4%甲醛固定,取出全脑。 4%甲醛外固定3 d,后进行常规石蜡包埋切片,厚度为4 μm。 石蜡切片分别进行HE 染色和免疫组化染色。

HE 染色:常规梯度乙醇脱蜡,PBS 冲洗3 min×3 次,经苏木精染色、氨水反蓝、伊红染色后,脱水透明封片。 观察小鼠纹状体和黑质部分神经细胞的形态、数量和分布。

免疫组织化学染色:按照免疫组化检测试剂盒步骤进行脱蜡、PBS 冲洗、3% H2O2抗原修复和血清封闭。 滴加一抗 TH 抗体(1 ∶300),4℃过夜后顺次滴加试剂1(放大信号)和试剂2(二抗),各孵育15 min,PBS 冲洗后进行DAB 显色、苏木精复染,脱水透明封片。 观察小鼠纹状体和黑质部分TH 阳性细胞的形态、数量和分布。

1.4 统计学方法

所有实验数据采用3 次测量取平均值的方式进行采集,使用SPSS 17.0 统计学软件进行分析,用平均数±标准差()表示,不同组之间的差异用t检验比较分析,P＜0.05 为具有显著性差异。

2 结果

2.1 震颤麻痹评分

腹腔注射MPTP 后5 ～30 min,小鼠相继出现竖毛、弓背、间歇性小震颤,继而可出现吞咽频繁至流涎,后肢张开至四肢僵硬,震颤频率逐渐增加,直至出现可持续数十秒的持续性震颤,60 min 后出现活动减低。 由于连续7～10 d 给药,随着体内积累药量增加,小鼠出现活动减低现象时间逐渐提前,其他现象则渐不明显,所以将第一次给药评分作为震颤麻痹评分,各剂量组均数作为该组震颤麻痹评分。 可见对照组无震颤麻痹现象,随单体次药剂量增加,小鼠震颤麻痹现象加重。 各组震颤麻痹评分见表1。 给药过程中有小鼠由于药物反应死亡,后续检测中30 mg/kg组和35 mg/kg 组实际测量分别为7 只、9 只。

2.2 旷场实验

将旷场实验连续测量5 d 的评分计算均数,作为单只受试鼠的评分,将各剂量组均数作为该组旷场实验评分,具体结果见表2。 可见与对照组相比,给药组的评分明显增高,但30 mg/kg 组评分高于35 mg/kg 组。

2.3 爬杆实验

通过预实验发现,随着不断训练,小鼠爬杆实验完成时间会不断变短,所以将停药后第三天的爬杆实验评分作为最终记录评分,各剂量组均数作为该组爬杆实验评分,见表3。 可见与对照组相比,给药组的评分明显增高,30 mg/kg 组与35 mg/kg 组无显著性差异。

2.4 悬挂实验

小鼠由停药第6 天开始,悬挂实验症状逐渐恢复,现将悬挂实验停药第3 ～5 天的评分计算均数,作为单只受试鼠的评分,将各剂量组均数作为该组悬挂实验评分,具体结果见表4。 可见与对照组相比,给药组的评分明显增高,且随着给药剂量的增加,评分也随之增高。

2.5 游泳实验

将游泳实验连续测量5 d 的评分计算均数,作为单只受试鼠的评分,将各剂量组均数作为该组游泳实验评分,具体结果见表5。 可见与对照组相比,给药组的评分明显增高,但30 mg/kg 组评分高于35 mg/kg 组。

2.6 综合统计

将各受试鼠的五项行为学测试评分加和,统计各组每只受试鼠行为学总得分。 见表6。

表1 震颤麻痹评分Table 1 Paralysis agitans score

表2 旷场实验Table 2 Field test

表3 爬杆实验Table 3 Pole test

表4 悬挂实验Table 4 Traction test

表5 游泳实验Table 5 Swim test

表6 综合得分Table 6 Comprehensive score

2.7 形态学检测

将各组小鼠分别取脑,对黑质和纹状体分别行HE 和TH 抗体免疫组化染色,见图1、图2。

通过HE 染色,可以确定黑质区域神经元细胞以及纹状体神经纤维的分布和形态。 进一步行TH抗体免疫组化染色,发现模型组在黑质区域存在多巴胺能神经元数量减低,纹状体区域出现TH 阳性神经纤维数量减少的现象,能够在形态学上认定帕金森模型制作成功。

图1 黑质HE 和TH 抗体免疫组化染色Note.The upper line corresponds to the HE staining results of control group and 23 ～35 mg/kg groups,respectively.The next line corresponds to the TH immunohistochemical results of control group and 23～35 mg/kg groups,respectively.Figure 1 HE staining results and TH immunohistochemical results of the substantia nigra

图2 纹状体HE 和TH 抗体免疫组化染色Note.The upper line corresponds to the HE staining results of control group and 23 ～35 mg/kg groups,respectively.The next line corresponds to the TH immunohistochemical results of control group and 23～35 mg/kg groups,respectively.Figure 1 Figure 2 HE staining results and TH immunohistochemical results of the corpus striatum

3 讨论

MPTP 自上世纪80 年代发现以来,已广泛应用于帕金森化学损毁模型的制备。 其可以引起灵长类和啮齿类动物脑内黑质和纹状体区域多巴胺能神经元死亡,这与帕金森病的病理改变较为类似,由此也引起该动物模型产生与帕金森病相类似的形态学表现[3]。 TH 在多巴胺能神经元中含量较高,其水平能够反应该神经元的位置和功能,因此,检测黑质和纹状体区域TH 表达的区域和变化,可以反映出多巴胺能神经元的位置和数量,由此判断MPTP 诱导的帕金森模型的严重程度[4]。

帕金森病症状是由多种原因相互影响产生的,例如肌张力增强可导致协调障碍,进而引起运动减低。 而动物的行为学表现又同时受到客观能力和主观意愿的影响,所以单一的行为学实验很难准确的反映出帕金森动物模型是否成功及其严重程度[5]。 本实验选取了与帕金森病相关且较为常见和简便易测的五种行为学评价方法[6-9],包括了运动能力、协调性、肌力、主观意愿等各个方面,以期通过多个实验来综合评价,为分析行为学检测和形态学指标的关联性奠定基础。

震颤麻痹评分是与给药剂量直接相关的指标,多数研究对其以观察现象为主,少有通过量表进行评分[10],这主要由两个因素造成,一是随着给药的次数增加,小鼠活动减低时间前提并延长,很多症状趋于隐匿；二是相同给药剂量情况下,小鼠表现较为相近,长时间观察区分较为困难。 针对这两个问题,本研究选取了多个给药剂量,且以表现最为明显的给第一次给药作为观察点,震颤麻痹评分的区分度较好。 给药组与对照组差别显著,且剂量依赖性明显,增大剂量后,评分也随之增高,但同时发现30 mg/kg 以上剂量,会出现由于不耐受药物而产生的动物死亡,两组累计死亡4 只,这与国外一般认为的45 mg/kg MPTP 剂量以内不会出现实验动物死亡的报道不相符[11]。

旷场实验、爬杆实验和游泳实验中,除与对照组存在显著性差异外,25 mg/kg 的低剂量组与30 mg/kg 和35 mg/kg 的中高剂量组也存在较为明显的差异。 同时30 mg/kg 和 35 mg/kg 间差别不明显,反而出现个别评分与剂量相反的情况,说明给药剂量存在一个较为明显的阈值,超过该阈值后,这三个实验的行为学表现没有明显的增强趋势。此外由于小鼠对爬杆实验适应性较强,反复测量会明显降低评分[12],本研究在给药前3 d 开始每天对小鼠进行训练,使其适应爬杆环境,间隔7 ～10 d 的给药期和2 d 的稳定期后,在给药结束后第3 天直接测量爬杆实验评分,力求避免小鼠适应性对爬杆实验评分的影响。

有研究显示悬挂实验的稳定性较好,一般可以持续到给药结束一到二周才会出现明显的症状消退[13],本研究发现在悬挂实验评分在第6 天即出现明显降低,模型动物力量明显升高,因此仅统计了停药后3～5 d 的评分。 在每天评价中的三次测量基本得分一致,在停药5 d 的跨度中变化也较小。悬挂实验主要反应了小鼠的肌力情况,与对照组相比,给药组有明显的评分增高,而在给药组内,三个剂量组也均有显著差别,说明肌力随给药剂量增加而持续下降。 但是抓握能力下降也与协调性和精细运动障碍有关,所以此实验仍有其他因素加入,不能认为仅反映肌力情况。

本研究将五个行为学实验整合起来,统计综合得分,进行组间对比,可见三个给药组与对照组均存在显著性差异,说明即使给予低剂量药物,也能引起动物模型类帕金森病的行为学改变。 低剂量组与中高剂量组间也存在显著性差异,说明给予中高剂量药物会使此类行为学改变显著增强。 但是中高剂量组间无显著性差异则说明,给药剂量存在某一阈值,给予超过阈值剂量的MPTP,行为学改变不会进一步出现显著性增强,但会出现药物致死现象。

以往研究中由于单一行为学评估手段的不稳定性,多采用形态学手段进行模型判定[3-5]。 这就要求必须抽样处死一批造模动物进行判定,既增加了实验的复杂性,也不能保证存活动物一定能够达到模型成功标准。 本研究进行整合行为学评分与形态学表现关联分析,以形态学结果为判定标准,进一步分析发现整合评分达到7.5 分以上的模型可以确定造模成功,6 分以下可以确定造模失败,提示整合行为学评估手段对模型判定较以往单一行为学检测方法更为准确,与形态学检测结果一致性更强。 同时在总体趋势上整合行为学评分较高的个体形态学表现也更为明显,可以认为帕金森病严重程度较高,进一步可以对模型的严重程度进行简单的划分。

因此,本研究采用的整合行为学评分方法可以提高MPTP 诱导C57BL/6 小鼠帕金森动物模型制备标准及其以此动物模型为基础的相关科学研究的科研数据的可靠性。 在今后的研究中,以此为切入点,增强模型稳定性,优化整合评估手段,可以使MPTP 诱导C57BL/6 小鼠帕金森模型的制备和评估更加简便准确。