油炸提取工艺对大黄中指标性成分的影响*

汲丽丽，吕邵娃，侯立强，杨志欣

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040 2.黑龙江中医药大学 第二附属医院，黑龙江 哈尔滨 150001）

中药一般采取煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流提取法等提取有效成分，对药材中水溶性成分的提取率较高[1]。近年来，油炸为传统膏剂药料提取法具独特提取优势，能充分富集药材中脂溶性、非极性等成分，引起了研究人员的广泛关注。传统膏药制备时，常将中药饮片放入麻油浸泡，在高温下油炸，提取药物有效成分[2]。现代研究证实，油在高温下会发生氧化、聚合等一系列复杂生化反应，并生成醛、酮、低级脂肪酸等低分子物质，这些分解产物是否会与药材中有效成分结合，提高其溶出度，仍需进一步研究。基于油炸提取优势，本课题组聚焦大黄，探索油炸提取对大黄中有效成分的影响。大黄作为大宗药材，别名将军[3]，《神农本草经》载其“下瘀血，血闭，寒热，破症瘕积聚，留饮宿食[4]”。在治疗烧烫伤等皮肤疾病方面具突出疗效，其中大黄素、大黄酚等蒽醌类成分是大黄重要的活性成分[5]，2015版《中国药典》将其作为质量控制的指标成分[6]。现代研究证实大黄素、大黄酚还具抗炎、抑菌、抗病毒等优良药理作用[7]，通过油炸提取后，大黄素、大黄酚会产生何种变化？基于此，本课题组以大黄素、大黄酚为指标性成分，建立大黄油提取物的含量测定方法，对油炸大黄的温度、油量、浸泡时间等进行考察，以期丰富大黄中指标性成分的提取工艺。

1 实验部分

1.1 材料及仪器

UItiMate3000色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；N-1100旋转蒸发仪（埃朗国际科技有限公司）；SHB-III循环水式多用真空系（郑州长城科工贸有限公司）；SB-5200D型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ZDHW型调温型电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）；ME155DU型1/10万电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；DJ1000A电子天平（莆田市亚太计量仪器有限公司）；HH-S2恒温水浴锅（上海精宏仪器设备有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博远实业有限公司医疗设备厂）。

大黄素对照品（批号：18041909 HPLC＞98% 中国药品生物制品检定所）；大黄酚对照品（批号：18672210 HPLC＞98%中国药品生物制品检定所）；大黄购自哈尔滨普方药业饮片有限公司，经鉴定为蓼科植物药用大黄Rheum officinale Baill.干燥根和根茎。甲醇、磷酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为纯净水（娃哈哈集团有限公司）；芝麻油为食用级（批号SC10223010300303哈尔滨市美狮实业有限公司）。

1.2 供试品溶液的制备

取油提取物10mL，加石油醚50mL，稍搅拌，加10%盐酸溶液50mL，取下层，加三氯甲烷25mL，加热回流1h，放冷，将混合溶液转移至分液漏斗中，加三氯甲烷提取3次，每次10mL，合并三氯甲烷，回收至干，加少量甲醇溶解，定容于1mL容量瓶中，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

1.3 对照品溶液的制备

精密称取5mg大黄素对照品，加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液，摇匀，即得大黄素对照品溶液。精密称取5mg大黄酚对照品，加甲醇制成每1mL含0.014mg的溶液，摇匀，即得大黄酚对照品溶液。

1.4 色谱条件

Venusil C18Plus（4.6×250mm，5μm）；流动相为甲醇：0.1%H3PO4（85∶15），检测波长：254nm，流速：1.0mL·min-1，柱温：30℃，进样量 20μL，在此色谱条件下测定，结果见图1～4，大黄素、大黄酚的峰与相邻峰基线分离较好，大黄素、大黄酚的理论塔板数不低于2000，可知该方法专属性良好。

图1 空白样品液相色谱图Fig.1 Liquid chromatogram of blank sample

图2 对照品液相色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of reference material

图3 样品液相色谱图Fig.3 Sample liquid chromatogram

图4 缺大黄阴性样品液相色谱图Fig.4 Liquid chromatogram of rhubarb negative sample

1.5 线性关系考察

1.5.1 线性及相关系数 取对照品溶液1、3、5、7、10、20、25μL，在 2.1.3 条件下进样分析。以进样浓度（mg·mL-1）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程为；大黄素Y=66.226x+0.0781（R2=0.9999），线性范围 0.01～6.25μg，大黄酚 Y=74.046x+0.127（R2=0.9999），线性范围 0.014～8.75μg。

1.5.2 精密度试验 取对照品溶液，按“1.4”项色谱条件下进样测定6次，测得大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为0.32%和0.44%，表明仪器精密度良好。

1.5.3 稳定性试验 按“1.2”项下方法制备供试品溶液，在室温下分别放置 0，2，4，8，12，24h 后进样，依法测定，结果显示大黄素和大黄酚峰面积RSD为1.60%和1.29%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

1.5.4 重复性试验 取油提取物6份，按“1.2”项下方法制备供试品溶液，在“1.4”项色谱条件下进样测定，测得大黄素的平均含量为 1.457μg·mL-1，RSD 为3.190%（n=6），大黄酚的平均含量为 1.525μg·mL-1，RSD为1.315%（n=6）。表明该方法有良好的重现性。

1.5.5 加样回收率试验 取已知含量的供试品溶液6份，分别精密加入含大黄素（2μg）、大黄酚（2μg）在“1.4”项色谱条件下进样测定，依法测定，计算回收率。两种成分平均回收率分别为大黄素97.94%和大黄酚98.59%；RSD分别为1.05%，1.10%。两种成分的加样回收率介于97%～98%之间。

2 油炸提取单因素考察

2.1 油量考察

称取大黄（0.75g）、芝麻油置不锈钢杯中，选取5个水平（3～12倍量）香油进行考察，具体工艺流程如下：大黄→加油（3～12倍量）浸泡 12h→200℃油炸（4h）冷却，过滤→得5份油提取物，据上述色谱条件测定大黄素、大黄酚含量。结果见表1、2、图5。

表1 芝麻油量对大黄素影响结果（n=3）Tab.1 Effect of sesame oil on emodin（n=3）

表2 芝麻油量对大黄酚影响结果（n=3）Tab.2 Effect of sesame oil on chrysophanol（n=3）

图5 芝麻油量对提取工艺的影响Fig.5 Effect of sesame oil quantity on extraction process

由图5、表1、2可知，随油量的增加，大黄素和大黄酚的含量先逐渐增加后降低，当油到达5倍量为大黄油炸的最佳香油用量。

2.2 油炸时间

称取大黄（0.75g）、芝麻油置不锈钢杯中，选取10个水平（0.5～5h）油炸时间进行考察，具体工艺流程如下：大黄→加油浸泡12h→200℃油炸（0.5～5h）→冷却，过滤得10份油提取物，测据上述色谱条件定大黄素、大黄酚含量。结果见表3、4、图6。

表3 油炸时间对大黄素影响结果（n=3）Tab.3 Effect of frying time on emodin（n=3）

表4 油炸时间对大黄酚影响结果（n=3）Tab.4 Effect of frying time on chrysophanol（n=3）

图6 油炸时间对提取工艺的影响Fig.6 Effect of frying time on extraction process

由图6、表3、4可知，随着油炸时间的增加，大黄素和大黄酚的含量先逐渐增加后降低，当油炸时间到达3.0～4.0h为大黄最佳油炸时间。

2.3 浸泡时间

称取大黄（0.75g）、芝麻油置不锈钢杯中，选取5个水平（2～36h）的浸泡时间进行考察，具体工艺流程如下：大黄→加油浸泡（2～36h）→油炸（220℃炸4h）→冷却，过滤→得5份油提取物，结果见表5、6、图 7。

表5 浸泡时间对大黄素影响结果（n=3）Tab.5 Effect of soaking time on emodin（n=3）

表6 浸泡时间对大黄酚影响结果（n=3）Tab.6 Effect of soaking time on chrysophanol（n=3）

图7 浸泡时间对于提取工艺的影响Fig.7 Effect of soaking time on extraction process

由图7和表5、6可知，随着浸泡时间的增加，大黄素和大黄酚的含量先逐渐增加后降低，当浸泡时间到达12h时达到最大，因此，浸泡12h为大黄最佳浸泡时间。

2.4 油炸温度

称取大黄（0.75g）、芝麻油置不锈钢杯中，选取5个水平（90～240℃）油炸温度进行考察，具体工艺流程如下：大黄→加香油浸泡（12h）→油炸（90～240℃）→冷却，过滤得5份油提取物。测定大黄素、大黄酚含量。结果见表7、8、图8。

表7 油炸温度对大黄素影响结果（n=3）Tab.7 Effect of frying temperature on emodin（n=3）

表8 油炸温度对大黄酚影响结果（n=3）Tab.8 Effect of frying temperature on chrysophanol（n=3）

图8 油炸温度对于提取工艺的影响Fig.8 Influence of frying temperature on extraction process

由图8和表7、8可知，随着油炸温度的增加，大黄素和大黄酚的含量先逐渐增加后降低，当油炸温度到达 120～220℃时达到最大，因此，油炸 120～200℃为大黄最佳油炸温度。

2.5 粉碎度

选取3个水平（不打粉、20目、40目）的粉碎度进行考察，具体工艺流程如下：大黄→加5倍量香油浸泡12h→200℃油炸4h→冷却，过滤得5份油提取物，测定大黄素、大黄酚含量，见表9、10，见图9。

表9 粉碎度对大黄素影响结果（n=3）Tab.9 Effect of grinding degree on emodin（n=3）

表10 粉碎度对大黄酚影响结果（n=3）Tab.10 Effect of grinding degree on chrysophanol（n=3）

图9 粉碎度对提取工艺的影响Fig.9 Effect of grinding degree on extraction process

由图9、表9、10可知，随粉碎度增加，大黄素和大黄酚的含量先逐渐增加后降低，40目时为当大黄最佳粉碎目数，但考虑到药材打粉后，在油炸过程中需时时搅拌，以防糊锅，建议在临床生产时，不打粉。

3 讨论与结论

本实验通过对大黄油炸提取工艺单因素考察，可确定其最佳前提取工艺为：称取大黄（0.75g），加入5倍量香油，浸泡12h，在200℃下油炸为3～4h取出、放凉备用。在上述条件下大黄中大黄素、大黄酚等指标性成分在其油提取液中富集度最高。综上所述，本实验不仅建立了大黄油炸提取工艺，还成功建立在此提取工艺下大黄素、大黄酚含量测定方法，为大黄指标性成分的提取研究提供了重要实验依据，但油炸提取法对大黄中其它成分的影响，仍需进行进一步的检测和研究。