芒果叶中总黄酮提取工艺优化及金属离子螯合活性研究*

关 丽,赵惠茹,许 菲,李伟泽，徐远涛

（1.西安医学院 药学院，陕西 西安710021；2.陕西盘龙药业集团股份有限公司，陕西 柞水714000）

芒果叶因其富含具有生物活性的黄酮类化合物而备受关注，提取工艺研究主要集中在使用微波辅助提取法和超声提取法[14-16]。微波提取具有加热时间短、产品质量好、易实现自动化控制等优点但提取过程处于密封系统，短时间内无法确定较适宜的提取温度及物料受高温加热处理，势必影响提取效果；超声提取法工艺简单便捷，但使用微波提取与超声提取方法提取效果均不佳。本实验采用星点设计-响应面法研究芒果叶中总黄酮的乙醇回流提取工艺，并测试总黄酮的金属离子螯合活性，为进一步研究芒果叶中总黄酮的生物活性提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

UV-762紫外可见分光光度仪（上海伟科仪器仪表有限公司）；SHZ-DIII循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；DZTW调温电热套（北京市水红明医疗仪器）；KQ5200B型超声波清洗器；恒温水浴锅（江苏科伟实验设备有限公司）；FA1004B电子精密天平（上海越平科学仪器有限公司）。

芒果叶（采自广西南宁，经西安医学院药学院高级实验员边军昌鉴定为漆树科植物芒果Mangifera indica L.的叶）；芦丁对照品（西安应化生物技术有限公司，批号：150213，纯度≥98%）；95%乙醇（天津市红岩试剂厂）；NaNO2（天津市风船化学试剂有限公司）；Al（NO3）3（天津市红岩试剂厂）；NaOH（天津市科密欧有限公司）；石油醚（天津市富宇精细化工有限公司），ZnSO4、CuSO4、FeCl3和 FeSO4均购自国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为市售分析纯，水为超纯水。

1.2 实验过程

1.2.1 总黄酮得率的测定

1.2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取0.0502g芦丁对照品，加适量60%乙醇溶解，定容至100mL容量瓶中得0.5020mg·mL-1得芦丁对照溶液，备用。

1.2.1.2 芦丁标准曲线绘制[17]分别量取芦丁对照溶液 2、3、4、5、6、7mL 于 25mL 容量瓶中，加 1mL 5%NaNO2静置 6min 后加 1mL 10%Al（NO3）3，再静置6min后加5mL 4%NaOH，最后用60%乙醇定容摇匀静置15min，以空白试剂为对照用紫外可见分光光度仪于510nm波长处下测定吸光度。以芦丁对照溶液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标建立芦丁的标准曲线，得标准曲线方程y=5.2855x-0.017，R=0.9996，表明芦丁在 0.0416～0.1205mg·mL-1范围内具良好的线性关系。

1.2.1.3 总黄酮得率测定 称取1.00g芒果叶粉末在不同条件下加热回流提取两次，合并两次提取液抽滤并过滤后量取体积得提取液。精密量取一定体积的提取液于适量大小容量瓶中，加1mL 5%NaNO2溶液，静置6min后加1mL 10%Al（NO3）3溶液，再静置6min后加5mL 4%NaOH，用60%乙醇定容静置15min，按2.1.2项下操作，根据标准曲线方程计算芒果叶提取液的总黄酮含量Q（mg·mL-1），利用提取液中总黄酮得率计算芒果叶中总黄酮得率T（%）。

有了上述分析，学生不难回答问题3-1，“下标和相等”的前提是等式左右两边的项数要相同.比如，等式两边都是3项，即有结论：在等差数列{an}中，若m+n+l=p+q+r，则am+an+al=ap+aq+ar.

总黄酮得率 T（%）=Q×D×V/1000W×100%

式中 Q：芒果提取液中总黄酮含量，mg·mL-1；D：稀释倍数；V：提取液体积，mL；W：芒果叶粉末质量，g；总黄酮得率T（%）：提取所得总黄酮与所用芒果叶的质量比。

1.2.2 提取条件的单因素试验 文献调研发现[18]在黄酮提取中，提取时间、乙醇浓度和料液比对提取含量的影响较大。故设计实验分别以乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）为单因素进行实验。

1.2.2.1 乙醇浓度 精密称取7份芒果叶粉末，每份约1g，分别加35mL浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，加热回流45min，提取两次。总黄酮得率测定方法见1.2.1.3。

1.2.2.2 提取时间 精密称取6份芒果叶粉末，每份约1g，每份加35mL浓度为60%的乙醇，分别加热回流 15、30、45、60、75、90min，提取两次。总黄酮得率测定方法见1.2.1.3。

1.2.2.3 料液比 精密称取5份芒果叶粉末，每份约1g，每份先加10mL 40%乙醇溶湿后分别加料液比为 10、15、20、25、30 浓度为 40%的乙醇，加热回流45min，提取两次。总黄酮得率测定方法见1.2.1.3。

1.2.3 星点设计 综合考虑单因素实验的结果，使用Design-Expert8.06软件安排中心点设计实验，选择提取时间、乙醇浓度、料液比3个因素分别为A、B、C，每个因素设为五个水平，用-α、-1、0、1、+α 表示。以总黄酮含量T（%）为响应值。

1.2.4 验证试验 按照星点设计最终优化条件进行验证试验，方法同单因素试验。

1.2.5 金属离子螯合活性 取验证试验后得到的提取液0.5mL于100mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度。分别将 FeSO4、CuSO4、FeCl3、ZnSO44 种金属离子盐配置成含金属离子100μM的溶液，再分别与提取液进行体积1∶1混合，稀释成含金属离子浓度为50μM的芒果叶总黄酮溶液。使用紫外分光光度计在200～500nm范围内对含金属离子的总黄酮液进行全波长扫描。

2 结果与讨论

2.1 单因素考察结果

2.1.1 乙醇浓度对提取率的影响 图1A表明：随着乙醇浓度增大，总黄酮含量增加，在40%时达到最佳，当乙醇浓度超过40%后，黄酮含量明显下降。可能是因为随着乙醇浓度不断增大，溶剂极性变小，黄酮溶解度降低。因此，选择回流提取的乙醇浓度为30%～60%进行响应面优化。

2.1.2 提取时间对提取率的影响 图1B表明，随提取时间延长，总黄酮含量缓慢增加，在45min时达到最佳，当提取时间超过45min后，黄酮含量缓慢下降。因此，选择回流提取时间为40～75min进行响应面优化。

2.1.3 料液比对提取率的影响 图1C表明，随料液比增大，总黄酮含量增加，在1∶25时达到最佳，当料液比超过1∶25后，黄酮含量缓慢下降。可能是因为随着溶剂量增加，黄酮溶解度增大，但溶剂量过大又会减弱体系的传质和传热，不利于提取。因此，选择回流提取的料液比为1∶15～1∶30进行响应面优化。

图1 单因素实验Fig.1 Single factor experiments

2.2 试验设计与结果

通过单因素试验选出最佳的提取时间、乙醇浓度、料液比范围，进行星点设计，结果见表1。

表1 实验因素与水平表Tab.1 Factors and levels table of test

以总黄酮含量T（%）为响应值，星点设计最终有20组试验方案，结果见表2。

表2 试验设计及结果Tab.2 Experimental design and results

采用Design Expert 8.0.6软件对数据进行拟合，得到回归方程为Q=10.31-1.42A+0.27B+0.011C+0.19AB-0.11AC-0.44BC-0.59A2-0.24B2-0.47C2，并进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis

由表 3 可知，该模型 P＜0.01，失拟项 P＞0.05，相关系数R2=0.8184，说明该回归方程的拟合度较好，结果可靠。A、B、AB、A2项的 P＜ 0.05，对总黄酮含量（T）均有显著性影响，再绘制效应面图，见图2。

由此得到，芒果叶总黄酮富集纯化的最优工艺为乙醇浓度34%、料液比23mL·g-1、提取时间60min，总黄酮含量为19.17%。

图2 效应面图Fig.2 Response surface plot

2.3 验证试验

按照优化工艺进行验证试验，平行3次，测得总黄酮含量分别为11.65%、11.12%、11.24%，平均11.34%，与预测值（19.17%）相当（RSD=2.45%）。表明该工艺稳定可行。

2.4 金属离子螯合活性

使用紫外分光光度计在200～500nm范围内对不含或者含 FeSO4、CuSO4、FeCl3、ZnSO44 种金属的总黄酮液进行全波长扫描，将得到的数据结果使用Origin 8处理，实验结果见图3。

图3 金属离子对芒果叶总黄酮螯合的影响Fig.3 Chelation effect of metal ions on total flavonoids in mango leaves

将不加金属离子溶液的芒果叶提取液与加入后的对比，曲线之间吸光度变大表示芒果叶总黄酮与金属离子发生螯合。图中可以看出，芒果叶总黄酮对Cu2+的螯合作用最强，对Fe2+和Fe3+的螯合作用稍弱，对Zn2+的螯合作用不明显。因此，芒果叶总黄酮对金属离子的螯合作用有望应用于阿尔茨海默症的治疗中。

3 结论

星点设计-效应面法是一种常用的实验设计和优化方法，具有实验次数少、精度高、模型预测效果好等优点，被广泛应用在医学、药学、化工、食品等领域。本研究是以乙醇浓度、料液比、提取时间为自变量，总黄酮提取量为因变量，采用星点设计与效应面法对芒果叶中总黄酮的提取工艺进行优化，确定了最佳的提取工艺条件为乙醇浓度34%，提取时间60min，液料比23∶1；在此条件下黄酮类化合物的得率为11.34%，与预测值的偏差为2.45%，芒果叶中黄酮含量的实测值与响应面法优化的预测值接近，说明该模型可靠。

阿尔茨海默病患者脑内金属离子堆积，容易造成Aβ蛋白异常沉积从而导致神经损伤，因此，金属离子螯合剂可作为治疗阿尔茨海默病的靶点，目前FDA公布的处于临床研究的该类化合物有PBT2，它可以维持脑内铜离子和锌离子的稳态[19]，芒果叶中总黄酮对金属离子的螯合活性为我们从天然产物中寻找金属离子螯合剂提供了一个新思路。