柴胡疏肝汤对自发性高血压大鼠ROCK/JNK信号通路及动脉粥样硬化的影响*

王鸿燕，黄正新，及 孟，赵月娥

（海南省中医院心血管科，海南海口570203）

高血压病是由多种病因相互作用引起的一种心血管综合征，随着社会发展，其发病率逐年增加，且越来越年轻化。研究报道，我国青少年高血压的患病率约15%，15 岁及以上人群高血压患病率高达24%，青少年罹患高血压增加其成年期心血管疾病发生的风险［1-2］。高血压病会导致全身循环动脉压升高，对其靶器官造成严重损伤，包括动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）、动脉内膜增厚、心室肥大等。目前，大量研究表明，高血压引起体内激烈的氧化应激反应造成内皮功能障碍，而血管内皮损伤与AS 的发生密切相关［3-4］。AS 是由于脂质超载巨噬细胞的积累导致动脉狭窄、泡沫细胞形成［5］。AS 不同阶段依赖于氧化应激、内皮功能障碍和炎症，而高血压或血脂异常可独立触发AS 不同阶段发生［6］。Rho 相关激酶（Rho-associated kinase，ROCK）/c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路与高血压动脉功能相关［7］。柴胡疏肝汤（Chaihu-Shugan de‑coction，CHSGD）有疏肝理气的功能，在高血压病舌象和代谢综合征中发挥重要作用，推测CHSGD 对高血压及AS 有一定治疗作用［8］。本研究观察CHSGD对自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）ROCK/JNK信号通路及AS的影响，以期为CHSGD临床治疗高血压病提供一定科学依据。

材料和方法

1 实验动物

8 周龄雄性 Wistar SHR 50 只，体质量（250.12±5.04）g，同周 龄雄性 Wistar 大 鼠 10 只 ，体质 量（249.36±4.35）g，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号为SCXK（京）2018-0013，动物使用许可证号为SYXK（京）2018-0027。动物单笼单只饲养，自由取食饮水，适应性饲养1 周后进行实验。本研究经海南省中医院伦理委员会批准［批准号：2018（伦审）0137］。

2 试剂及仪器

CHSGD 由柴胡 6 g、陈皮 6 g、芍药 4.5 g、香附4.5 g、枳壳 4.5 g、川芎 4.5 g 和炙甘草 1.5 g 组成，加水 1 000 mL，浸泡 1 h，煎煮 30 min，煎 2 次，用 200 目滤网过滤去渣，将药液采用旋转蒸发仪浓缩，生药终浓度分别为0.25、0.5 和1 kg/L，消毒冷藏备用；复方罗布麻（compound kendir leaves，CKL；国药准字H14023052；片剂；批号20190713）购自山西津华晖星制药有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）试剂盒（货号50107ES50）购自上海翊圣生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（货号GL2091）购自北京百奥莱博科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（货号JT9344）购自北京吉美生物技术有限公司；抗RhoA抗体（货号 ab187027）、抗 ROCK1 抗体（货号ab45171）和抗 JNK 抗体（货号 ab112501）购自 Ab‑cam；辣根过氧化物酶标记的II 抗（货号BHR101）购自北京博尔西科技有限公司；RIPA 组织裂解液（货号SF1347）和BCA 蛋白浓度检测试剂盒（货号P0010S）购自上海碧云天公司。

智能无创血压计（型号BP-2010E）购自北京软隆生物技术有限公司；蛋白电泳及电转移装置（型号AU5800）购自北京市六一仪器厂；酶联免疫分析仪（型号EVO75）购自Tecan；全自动生化分析仪（型号7020）购自Hitachi；正置光学显微镜（型号Eclipse Ci）购自Nikon；超低温冰箱（型号MDF-U32V）购自Thermo。

3 方法

3.1 实验分组及干预 将50 只雄性Wistar SHR 随机分为模型（model）组、CKL 组和 CHSGD 低、中、高剂量（CHSGD-L、CHSGD-M 和CHSGD-H）组，另选10只同源雄性Wistar 大鼠为正常对照（normal control，NC）组。CHSGD-L、CHSGD-M和CHSGD-H组大鼠分别用 2.5、5 和 10 g/kg 的 CHSGD 灌胃［9］（生药终浓度分别为 0.25、0.5 和 1 kg/L，灌胃体积 10 mL/kg），分别是临床剂量的 0.4、0.8 和 1.6 倍；CKL 组用 0.5 g/kg CKL 灌胃［10］，灌胃体积 10 mL/kg；model 组和NC组大鼠用等体积（10 mL/kg）生理盐水灌胃。灌胃每日1次，连续4周。

3.2 各组大鼠生化指标的检测 治疗前和治疗4周后，在大鼠清醒平静状态下采用智能无创血压计测量鼠尾动脉血压。治疗4 周后，腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，从腹主动脉快速取血，离心取上清，采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血脂相关指标甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cho‑lesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density li‑poprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平；严格按照试剂盒说明书步骤检测血清中氧化应激相关指标NO、MDA和SOD的水平。

3.3 HE 染色观察各组大鼠主动脉组织的病理变化 治疗4 周后，腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，取主动脉弓以下的主动脉，固定，常规石蜡包埋、切片，二甲苯脱蜡、乙醇水洗、HE 染色、常规脱水，中性树脂封片，光学显微镜下观察拍照。

3.4 Western blot 检测主动脉组织中RhoA、ROCK1和JNK 的蛋白表达 治疗4 周后，腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，取主动脉，使用组织裂解液提取主动脉组织总蛋白，用BCA 法检测蛋白浓度后，进行SDS-PAGE，转膜，加I抗（RhoA、ROCK1、JNK 和β-ac‑tin 抗体，1∶2 000）4 ℃孵育过夜，次日洗膜后加辣根过氧化物酶标记的II抗（1∶5 000）室温孵育2 h，洗膜后加ECL 发光液，在凝胶成像系统中拍照，并进行灰度分析。

4 统计学处理

采用统计学软件SPSS 22.0进行数据分析，计量数据以均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠血脂水平的变化

治疗 4 周后，与 NC 组相比，model 组大鼠血清TG、TC 和 LDL-C 水平显著升高，HDL-C 水平显著降低（P＜0.05）；与 model 组相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 组大鼠血清 TG、TC 和 LDL-C水平显著降低（P＜0.05）；与CKL 组相比，CHSGD-L和 CHSGD-M 组大鼠血清 TG、TC 和 LDL-C 水平显著升高（P＜0.05），而 CHSGD-H 组与 CKL 组大鼠血清TG、TC 和 LDL-C 水平的差异无统计学显著性（P＞0.05），见表1。

2 各组大鼠血压的变化

治疗前，与 NC 组相比，model、CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 组大鼠血压显著升高（P＜0.05）。治疗 4 周后，与 NC 组相比，model 组大鼠血压显著升高（P＜0.05）；与 model 组相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 组大鼠血压显著降 低（P＜0.05）；与 CKL 组 相 比 ，CHSGD-L 和CHSGD-M 组 大 鼠 血 压 显 著 升 高（P＜0.05），而CHSGD-H 组与CKL 组大鼠血压的差异无统计学显著性（P＞0.05）。见表1。

3 各组大鼠主动脉组织的病理变化

HE 染色结果显示，NC 组大鼠内膜光滑平整，管壁细胞分布整齐，各层结构正常；model 组大鼠主动脉管径增厚，内皮下大量泡沫细胞形成，平滑肌细胞增生，排列紊乱；CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和CHS‑GD-H 组大鼠主动脉各层结构逐渐恢复正常，血管细胞排列较整齐，炎症细胞浸润较轻，见图1。

4 各组大鼠血清中NO、MDA和SOD水平的变化

治疗 4 周后，与 NC 组相比，model 组大鼠血清NO 和 SOD 水平显著降低，MDA 水平显著升高（P＜0.05）；与model 组相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M和CHSGD-H 组大鼠血清NO 和SOD 水平显著升高，MDA 水平显著降低（P＜0.05）；与 CKL 组相比，CHSGD-L 和 CHSGD-M 组大鼠血 清 NO 和 SOD 水平显 著 降 低 ，MDA 水平显著升高（P＜0.05），而CHSGD-H 组与 CKL 组大鼠血清 NO、SOD 和 MDA 水平的差异无统计学显著性（P＞0.05），见表2。

5 各组大鼠主动脉组织中RhoA、ROCK1 和JNK蛋白表达的比较

治疗4 周后，与 NC 组相比，model 组大鼠主动脉组织中RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与 model 组相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M和CHSGD-H 组大鼠主动脉组织中RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与CKL 组相比，CHSGD-L 和CHSGD-M 组大鼠主动脉组织中RhoA、ROCK1 和 JNK 蛋白表达显著升高（P＜0.05），而CHSGD-H 组与CKL 组大鼠主动脉组织中RhoA、ROCK1和JNK蛋白表达水平的差异无统计学显著性（P＞0.05），见图2及表2。

表1 各组大鼠血脂和治疗前后血压水平变化的比较Table 1.The changes of blood lipids after 4 weeks of treatment and the changes of blood pressure before and 4 weeks after treatment in the rats with different interventions（Mean±SD. n=10）

Figure 1.The images of the aorta with HE staining（×400）.a：NC group；b：model group；c：CKL group；d：CHSGD-L group；e：CHSGD-M group；f：CHSGD-H group.图1 各组大鼠主动脉组织HE染色图

Figure 2.The images of Western blot for determining the protein expression of RhoA，ROCK1 and JNK in the aorta of the rats with different treatments.a：NC group；b：model group；c：CKL group；d：CHSGD-L group；e：CHSGD-M group；f：CHSGDH group.图2 Western blot检测各组大鼠主动脉组织中RhoA、ROCK1和JNK蛋白的表达

表2 各组大鼠血清中NO、MDA和SOD水平及主动脉组织中RhoA、ROCK1和JNK蛋白表达的比较Table 2.The serum levels of NO，MDA and SOD，and the protein expression of RhoA，ROCK1 and JNK in the aorta of the rats with different treatments（Mean±SD. n=10）

讨 论

高血压和血脂异常是AS的独立危险因素，AS也是高血压和心肌梗塞等心血管疾病的危险因素［11-12］。研究表明，SHR 体内血脂异常，血清内皮素1（endo‑thelin-1，ET-1）、TC、TG 和 LDL-C 水平显著升高［13］。本研究发现，治疗4 周后，与NC 组相比，model 组大鼠血压及血清中TG、TC 和LDL-C 水平显著升高，提示SHR 存在高血压和血脂异常症状。HE 染色可见model组大鼠主动脉管径增厚，内皮下大量泡沫细胞形成，平滑肌细胞增生，排列紊乱，提示SHR 可能通过发生高血压造成血脂异常，从而使主动脉发生病变，出现AS症状。

高血压患者会出现头痛、头晕、尿液增多、胸闷、乏力等症状，临床上常用利尿药、钙通道阻滞剂、血管张素转换酶抑制剂等降压药，但长期服用对患者身体和经济造成较大的负担。中草药具有副作用小、成本低等特点，CHSGD 由柴胡、陈皮、芍药、香附、枳壳、川芎和炙甘草七味中药组成，为理气剂，主要归心、肝、肾经，具有疏肝理气、活血止痛之功效［14-15］。《神农本草经》记载，柴胡性微寒，味苦、辛，归肝经、胆经，具透表泄热、疏肝解郁、升举阳气之功效，用于肝郁气滞、胁肋胀满疼痛及肝郁血虚，与高血压患者头痛、头晕等症状吻合。研究表明，柴胡疏肝散可以降低高血压患者TG、TC 和LDL-C 的水平，具有调节脂质代谢、降血压作用［8］。本研究发现，治疗4 周后，与model 组相比，CKL、CHSGD-L、CHSGDM 和 CHSGD-H 组大鼠血压及血清中 TG、TC 和 LDLC 水平显著降低，CHSGD-H 组大鼠血压及血清中TG、TC和LDL-C水平与CKL组相比无显著差异；HE染色可见 CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 组大鼠主动脉各层结构逐渐恢复正常，血管细胞排列较整齐，炎症细胞浸润较轻，提示CHSGD 可降低SHR 血压，改善血脂情况，减轻主动脉损伤，缓解AS症状，且其浓度增加则作用增强。

高血压病导致的血管内皮损害会造成血脂异常患者的血管舒缩功能丧失，血管收缩不均衡和血压升高［16］。而高血压患者中，血压的进一步升高会形成自我延续的恶性循环，加剧恶性高血压病的发展和AS 病变进程。SOD 是评价氧化应激反应程度的指标；MDA 是自由基过氧化脂质的分解产物，是衡量脂质过氧化程度的重要指标；NO是由血管内皮细胞产生并释放的，可以反映血管内皮依赖性舒张功能［17］。本研究发现，与 NC 组相比，model 组大鼠 NO和SOD 水平显著降低，MDA 水平显著升高，提示高血压病发生与氧化应激反应相关。柴胡疏肝散可以降低 MDA 和 SOD 表达，抑制脂质过氧化反应［18］。本研究发现，与model 组相比，CKL、CHSGD-L、CHSGDM 和 CHSGD-H 组大鼠血清 NO 和 SOD 水平显著升高，MDA 水平显著降低，提示CHSGD 可能通过下调脂质过氧化产物MDA 及上调NO 和SOD 表达减轻氧化应激反应，降低血压，从而改善血管舒张功能。

ROCK1是RhoA 下游靶基因，与细胞增殖、迁移等功能相关。最近大量研究表明，RhoA/ROCK 通路在高血压、AS、糖尿病等疾病中发挥重要作用［19］。JNK 又称为应激活化蛋白激酶（stress-activated pro‑tein kinase，SAPK），属于MAPK 家族，在胞外基质的代谢和AS 形成中发挥重要作用。研究表明，抑制ROCK/JNK信号通路，可以减少血管平滑肌细胞过度迁移，减轻血管内膜增厚，与AS、心肌梗塞、中风等心血管疾病密切相关［20］。本研究发现，治疗4 周后，与NC 组相比，model 组大鼠主动脉组织中RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表达显著升高，提示RhoA、ROCK1和JNK可能参与自发性高血压的发生发展进程。进一步研究发现，与model 组相比，CKL、CHS‑GD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 组大鼠主动脉组织中RhoA、ROCK1 和 JNK 蛋白 表达显 著降 低 ，提 示CHSGD可能通过抑制ROCK/JNK 信号通路相关因子RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表达，减缓氧化应激反应，减轻AS症状。

综上所述，CHSGD 可抑制氧化应激反应，减轻AS 症状，可能是通过下调ROCK/JNK 信号通路相关蛋白RhoA、ROCK1 和JNK 表达实现的，但其具体作用机制仍需进一步研究。