羟基红花黄色素A对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清炎性因子及心肌组织NF-κB表达的影响

张 园，张 妍

心肌梗死是常见的严重心血管疾病，主要由冠状动脉急性持续性缺血缺氧引起心肌坏死，是威胁人类健康和导致死亡的主要原因[1]。临床治疗心肌梗死的手段主要通过药物溶栓、心脏搭桥或介入方式，恢复心脏缺血冠状动脉血液供应从而实现再灌注[2]。短时间内快速恢复缺血心肌血液供应造成缺血再灌注损伤，严重影响再灌注治疗及心脏功能恢复，甚至出现心律失常、心肌梗死病情加重、心力衰竭等危重事件[3]。因此，如何减轻再灌注损伤已成为目前心血管疾病治疗的研究热点[4]。

羟基红花黄色素A是一种重要的黄酮类化合物，属于查耳酮类化合物，是中药红花的主要药效成分，具有扩张冠状动脉血管、降血压、抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抗心肌缺血、抗肿瘤等多种药理作用[5-6]。为明确羟基红花黄色素A对心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制，本研究探讨羟基红花黄色素A对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清炎性因子及心肌组织核因子-κB(NF-κB)表达的影响，为临床防治心肌缺血再灌注损伤提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 取雄性SD大鼠50只，体质量(200±20)g由承德医学院实验动物中心提供。

1.1.2 实验药物及试剂 羟基红花黄色素A(大连美仑生物技术有限公司生产，批号A1228AS，纯度≥98%)，大鼠CD4、CD8酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒均购自上海将来实业股份有限公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)试剂盒均购自南京建成生物技术有限公司；NF-κB、NF-κB抑制蛋白激酶α(IκBα)、NF-κB抑制蛋白激酶β(Iκκβ)和β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；BCA蛋白测定试剂盒购自美国Thermo公司；ECL发光液和硝酸纤维素膜购自美国Millipoer公司。

1.2 实验仪器 小动物呼吸机(北京新利科技有限公司生产，HL-B6型)；生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司生产，型号BL-420S)；Spectra Max iD5-多功能酶标仪(中国上海美谷分子仪器有限公司)；H1650台式高速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组 50只雄性SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组、缺血再灌注组(模型组)、尼莫地平组(阳性药对照组，20 mg/kg)及羟基红花黄色素A高剂量组(20 mg/kg)、羟基红花黄色素A低剂量组(10 mg/kg)，每组10只。各组大鼠分别灌胃相应药物，假手术组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水。

1.3.2 药物干预 各组大鼠于造模前14 d分别灌胃给药，阳性药对照组灌胃尼莫地平(20 mg/kg)，羟基红花黄色素A高剂量组、低剂量组分别给予羟基红花黄色素A 20 mg/kg、10 mg/kg，假手术组和模型组大鼠灌胃等体积(5 mL/kg)生理盐水，药物干预期间各组大鼠常规饲养，自由饮食。

1.3.3 造模 通过结扎大鼠冠状动脉左前降支建立心肌缺血再灌注损伤模型[7]。各组大鼠于末次给药后禁食、不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后仰卧固定，颈部、心前区备皮，碘伏消毒，切开颈部皮肤，分离气管，以盐酸利多卡因浸润后，行气管插管，连接动物呼吸机(参数：潮气量为15 mL，呼吸频率为1∶2)。沿胸骨左缘第3肋与第4肋间切开皮肤2.0～2.5 cm，使用小开胸器轻轻撑开切口，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，使用止血钳将左心耳提起，确定冠状动脉左前降支(左心耳下方2 mm)，以0号缝合线行高位或中位活结结扎，快速将心脏送回胸腔，清除胸腔内空气和血液并关闭胸腔，术中监测心电图Ⅱ导联，以ST段、T波抬高作为判断造模成功与否的标准，结扎30 min后开胸，打开结扎线行再灌注，持续时间120 min，逐层缝合关胸，动物恢复自主呼吸。假手术组仅开胸、穿线但不结扎。测量各组大鼠缺血再灌注后左室舒张末期压力(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)和左室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)，评价心脏功能。

1.3.4 指标检测 各组大鼠缺血30 min再灌注120 min后，颈总动脉取血3 mL，室温静置2 h，4 ℃条件下3 000 r/min离心5 min，分离血清，即刻检测血清TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平。取血完毕后，再取各组大鼠左心室缺血区心肌组织(假手术组参照模型组相同部位取材)，采用Western Blotting法检测心肌组织NF-κB、IκBα和Iκκβ蛋白表达，具体方法为：液氮中研磨大鼠心肌组织，加入RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)裂解，BCA法进行蛋白定量，加5×上样缓冲液煮沸10 min，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后经PVDF膜转膜(电压100 V，90 min)，5%脱脂奶粉封闭过夜，NF-κB、IκBα、Iκκβ和内参β-actin等一抗(1∶1 000)稀释液室温孵育2h，再以辣根酶标记的二抗(1∶5 000)稀释液室温孵育1 h，加显色液显色，按照ECL试剂盒说明书进行操作，将发光液均匀地滴在PVDF膜上，反应1 min，最后将膜放入暗室显影。结果以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示，采用Image J软件对显影条带进行分析。

1.3.5 心肌组织病理学检查 取血完毕后，再取各组大鼠左心室缺血区心肌组织(假手术组参照模型组相同部位取材)，以4%的多聚甲醛溶液固定，4 ℃过夜，梯度乙醇脱水、石蜡包埋、制成4 μm切片，使用苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察左心室组织学改变。

2 结 果

2.1 各组心肌缺血再灌注损伤大鼠左心室组织变化 假手术组大鼠心肌纤维排列整齐有序，组织间隙水肿较轻微，仅有轻度瘀血，周围组织有微量渗出，血管轻度扩张。模型组大鼠心肌严重受损，心肌纤维扭曲断裂，细胞肿胀，组织间隙水肿，细胞核散乱无序，染色疏松。与模型组比较，羟基红花黄色素A各剂量组及尼莫地平组大鼠心肌纤维断裂较少，组织间隙肿胀较轻，心肌间隙血管扩张不明显，组织间隙水肿较轻。详见图1。

图1 各组心肌缺血再灌注损伤大鼠左心室组织光镜图(HE染色，400×) (A为假手术组；B为模型组；C为尼莫地平组；D为羟基红花黄色素A高剂量组；E为羟基红花黄色素A低剂量组)

2.2 各组心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏功能比较 与假手术组比较，模型组大鼠LVEDP升高，LVSP降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，羟基红花黄色素A高剂量组、低剂量组及尼莫地平组大鼠LVEDP降低，LVSP升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；羟基红花黄色素A高剂量组、低剂量组与尼莫地平组LVEDP、LVSP比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏功能比较(±s) 单位：mmHg

2.3 各组心肌缺血再灌注损伤大鼠血清炎性因子水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP炎性因子水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，羟基红花黄色素A高剂量组、低剂量组及尼莫地平组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP炎性因子水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；羟基红花黄色素A高剂量组、低剂量组与尼莫地平组TNF-α、IL-6、CRP炎性因子水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组心肌缺血再灌注损伤大鼠血清炎性因子水平比较(±s)

2.4 各组心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织NF-κB、IκBα 和 Iκκβ蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织NF-κB蛋白表达升高，IκBα、Iκκβ蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，羟基红花黄色素A高剂量组、低剂量组、尼莫地平组大鼠心肌组织NF-κB蛋白表达降低，IκBα、Iκκβ蛋白表达均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；羟基红花黄色素A高剂量组、低剂量组与尼莫地平组NF-κB、IκBα和Iκκβ蛋白表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图2。

与假手术组比较，*P<0.05； 与模型组比较，#P<0.05。图2 各组心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织 NF-κB、IκBα和Iκκβ蛋白表达比较

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤是指心肌缺血后血液供应恢复，但缺血性损害未恢复，反而进一步加重，其病理机制复杂，与心肌细胞凋亡、炎性因子产生及核转录因子调控等有关[8]。有研究表明，心肌缺血激活炎症反应，急性炎症反应又引起继发性心肌损伤，而再灌注又加重心肌急性炎症反应程度，心肌缺血再灌注引起机体炎症反应激活炎症细胞释放TNF-α、IL-6、CRP及干扰素等大量炎性因子，加重炎症反应[9]。

NF-κB是一种具有调控作用的核转录因子，在维持机体正常生理功能中发挥重要作用，介导机体炎症反应和免疫应答，并参与调控细胞周期、分化和凋亡[10]，静息状态时，存在于细胞质NF-κBp65、p50与IκBα组成的三聚体复合物，无活性；当NF-κBp65、p50、IκBα三聚体被炎症介质激活后，细胞中Iκκβ磷酸化为p-Iκκβ，级联NF-κB信号通路相关蛋白表达；IκBα蛋白激活NF-κB信号通路，由于NF-κB与IκBα亲和力较强，IκBα表达量高，可抑制NF-κB活化，而IκBα表达量低，NF-κB活化程度较高[11]。NF-κB活化后转运进入细胞核，促进白细胞介素(IL)-1、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等多种炎性因子表达[12]。有研究显示，NF-κB的异常激活与心肌缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡密切相关，心肌缺血再灌注发生时，激活心肌组织NF-κB信号通路，心肌组织NF-κB蛋白表达升高，IκBα、Iκκβ蛋白表达量降低[13]。本研究结果表明，羟基红花黄色素A高剂量组、低剂量组、尼莫地平组大鼠心肌组织NF-κB蛋白表达低于模型组，IκBα、Iκκβ蛋白表达高于模型组。

炎症反应是心肌缺血再灌注引起心肌损伤的重要病理特点之一，主要表现为心肌局部炎症细胞大量浸润并合成，分泌CRP、TNF-α、IL-6等多种炎性因子。其中，TNF-α由活化单核巨噬细胞产生，参与启动炎症级联反应，IL-6由活化的成纤维细胞和T淋巴细胞产生，与TNF-α协同发挥作用，介导并加重炎症反应，调控细胞增殖、分化和凋亡[14-15]。本研究结果表明，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平高于假手术组，表明心肌缺血再灌注大鼠体内存在持续性炎症反应，与相关文献报道[12]一致，而羟基红花黄色素A可降低心肌缺血再灌注大鼠体内TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平，减轻炎症反应。

本研究结果表明，羟基红花黄色素A对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，可抑制心肌细胞炎症反应，减轻心肌细胞损伤。本研究基于炎症反应，从NF-κB信号通路探讨羟基红花黄色素A防治心肌缺血再灌注大鼠的作用机制，有关羟基红花黄色素A治疗心肌缺血再灌注损伤大鼠的具体机制有待于进一步研究。