通过显微介导将鳜总DNA 片段导入镜鲤基因组的分子验证

闫学春，栾培贤，何立川

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

鱼类远缘杂交（distant hybridization）是对旧物种的改良和新物种的创造等重要鱼类育种途径之一[1]，目前，已在鱼类的杂种优势、抗寒育种、单性杂种、多倍体、提高起捕率、诱发雌核发育、抗病育种和诱发雄核发育等方面取得了进展[2-9]。但其不足就是杂交不易成功，种间隔离造成杂种不育，严重限制了远缘杂交亲本的选择范围。而显微介导远缘杂交技术可以弥补远缘杂交的不足。利用显微注射技术，将外源基因组DNA 转化到受体，是将经过改良的新的性状或相关性状直接转化受体的方法，克服了基因差异和生理差异所造成的远缘杂交原代不亲和和后代不育等障碍，最终实现直接进行外源DNA 水平的片段杂交[10-13]。但其检测方法不能用鱼类转单个基因中一些常用的外源基因整合鉴定和表达检测等技术，因为导入的外源总DNA 没有明确的分子标记和一致的序列结构。而使用扩增片段长度多态性（AFLP）技术不需要预先知道被研究鱼类的DNA 序列信息，在受体基因组中，通过检查扩增目的DNA 片段的有无，来找到外源总DNA 转化的分子证据，因此，AFLP 技术是一个快速检测总DNA 的好方法。有关AFLP 技术在鱼类总DNA 检测方面已有过报道[14-17]。

鳜Siniperca chuatsi 肉味鲜美，营养丰富，富含人体必需的氨基酸和钙、钾、镁、硒等营养元素，是一种名贵的肉食性淡水养殖鱼类。镜鲤Cyprinus carpio 生长快，是一个多栖息水域中下层的常规淡水杂食性鱼类。目前，已选育出适合池塘养殖的德国镜鲤选育系，也是主要的池塘鲤养殖品种之一[18-20]。本研究通过显微介导的远缘杂交技术，将未经遗传修饰的亲缘关系甚远的优异鳜基因组DNA 导入受体镜鲤中，通过这种基因组水平的超远缘杂交技术，改善镜鲤的肌肉品质；用AFLP 方法检测显微介导鳜基因镜鲤，验证了在受体亲本的基因组中整合了供体基因片段，再将与鳜相同的AFLP 条带进行切下、回收、测序，测序结果表明，供体鳜片段序列与显微介导的鳜镜鲤片段序列完全一致，进一步明确了外源基因组DNA 转化的分子证据。而显微介导外源总DNA 转化，为鲤科鱼类肌肉品质的改良，为鱼类远缘、超远缘物种间的基因交流提供了有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料

供体基因是鳜总DNA。实验鱼取自本课题组生产的显微介导的鳜基因镜鲤，显微注射用的镜鲤受精卵取自黑龙江水产研究所呼兰试验站。

1.2 方法

1.2.1 鳜基因组DNA 的提取

用2mL 无菌一次性注射器，在鳜的尾部采新鲜血液10～15μL，加入含有400μL 裂解液的1.5mL 离心管中，混匀，裂解液为100mM EDTA，pH=8.0。放入55℃水浴消化1h 左右，期间将离心管颠倒几次混匀，待溶液清澈透明后，取出离心管，加入等体积的体积比为酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1 的混合液，缓慢来回颠倒离心管15min，10000r/min 离心6min。另取一个干净离心管装入上层液体，加入2倍体积预冷的无水乙醇（沉淀DNA），混匀，-20℃处理2h，离心，沉淀加70%乙醇洗涤离心，加100μL TE（tris-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA）溶解。

1.2.2 外源基因的导入

在繁殖季节，采集高质量的卵子和精子进行人工受精，利用外源基因的导入技术，将未经遗传修饰的鳜基因组DNA 导入镜鲤受精卵的核区附近，注射量为1nL 左右。共导入2500 余粒镜鲤受精卵，孵出仔鱼1500 余尾，放入池塘300 尾正常饲养。

1.2.3 显微介导鳜基因镜鲤DNA 提取

取新鲜的鳍条，尽量剪碎装入1.5mL 离心管中，加入裂解液，消化，等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液抽提，预冷的无水乙醇沉淀，TE 溶解。具体实验鱼DNA 提取参见闫学春[21]。

1.2.4 AFLP 反应体系的建立

1.2.4.1 酶切连接

本实验选用了两种酶Mse I 和EcoR I 的酶切组合研究酶切效果。酶切总体系20μL，其中10×Buffer 2μL，BSA 0.2μL，模板DNA 400ng，Mse I 0.5μL，EcoR I 0.5μL，补ddH2O 至终体积20μL，混匀，37℃水浴2h，65℃灭活20min，终止酶切反应，冰浴。连接体系：在装有酶切产物的离心管中，依次加入Mse I 接头1μL、EcoR I 接头1μL、T4-DNA 连接酶0.5μL、连接酶Buffer 1μL，补ddH2O 至终体积30μL。过夜连接。

1.2.4.2 预扩增

在加有1μL 连接产物的试管中加入EcoRⅠ引物1μL、Mse I 引物1μL、Taq DNA 聚合酶0.1μL 和Buffer 14.4μL，加水至20μL。混匀后，按如下PCR 扩增 条 件：94℃变 性30s，56℃退 火1min，72℃延 伸1min，20 个循环，完成循环后再延伸6min（72℃）。

1.2.4.3 选择性扩增

建立25μL 选择扩增反应体系：加入稀释10 倍的预扩增产物1μL、MseⅠ选择扩增引物1μL、EcoRⅠ选择扩增引物1μL、Taq DNA 聚合酶0.3μL 和Buffer 18μL，加水至25μL。混匀后，按如下PCR 条件扩增：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，进行36 个循环，其中13 个循环后，每个循环复性温度降低0.7℃。

表1 AFLP 接头及引物序列Tab.1 Adapters and primers sequences of AFLP

1.2.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳

选择扩增产物中加入等体积上样缓冲液（去离子甲酰胺98%、10 mmol/L EDTA、0.25%溴酚蓝和0.25%二甲苯青），混匀，94℃变性10min 后，立刻冰浴冷却待用。取5μL 变性后的样品，6%的变性聚丙烯酰胺凝电泳检测，55W 恒定功率电泳，电泳约2.5h。取下胶板固定，银染[22，23]，照相，分析。

1.2.4.5 目的条带回收测序

PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将差异性条带回收，测序。

2 结果与分析

2.1 显微介导鳜基因镜鲤基因组DNA 提取

采用酚/氯仿混合提取方法提取的显微介导鳜基因镜鲤基因组DNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，基因组DNA 条带清晰无弥散。DNA 定量分析仪分析表明，提取的基因组DNA 的OD260/OD280均在1.8～2.0 之间，表明蛋白质、RNA 等杂质含量极少，提取的显微介导鳜基因镜鲤基因组DNA 纯度高，符合AFLP 的后续实验要求[24]（图1）。

2.2 AFLP 扩增结果

利用引物E-AGG，M-CTA，对显微介导鳜基因镜鲤基因组DNA 进行AFLP 检测，以鳜基因组DNA 为阳性对照，普通镜鲤基因组DNA 为阴性对照。在AFLP 的15 对引物中，在显微介导鳜基因镜鲤中有3 对引物均扩增出了供体鳜基因片段，在基因水平上验证了在受体亲本的基因组中已整合了供体鳜基因片段（表1、图2）。

2.3 产物回收测序结果

为进一步找到遗传证据，将与鳜相同的AFLP条带进行切下、回收、测序。测序结果表明，供体鳜片段序列与显微介导鳜基因镜鲤片段序列完全一致（图3）。

3 讨论

AFLP 是第三代分子标记技术，综合了限制性酶切片段多样性（RFLP）和聚合酶链式反应（PCR）的优点，分析结果灵活性高，稳定可靠，多态性丰富，不需要预知基因组的序列特征，适用于任何来源和各种复杂度的DNA[25]。自AFLP 技术问世以来，已广泛应用于遗传连锁图谱的构建、种质分析、遗传分析、指纹多态性和外源基因检测等方面。王朝溪等[26]利用AFLP 技术分析了青海湖裸鲤Gymnocypris przewalskii 群体间的遗传差异，构建了其扩增片段长度多态性的指纹图谱，研究结果为青海湖裸鲤的多样性检测和亲本选育提供了可靠的技术参数，对青海湖裸鲤资源库积累具有指导意义。严骏骢等[27]运用AFLP 技术从3 个层面分析了鲢Hypophthalmichthys molitrix 的土著群体、中国土著群体内和海外移居群体的遗传格局，结果表明3 个群体间的分化表现显著，为鲢的种质资源利用、保护和管理积累了基础资料。王志勇等[28]分析了官井洋大黄鱼Larimichthys crocea 指纹多态性的AFLP，为大黄鱼种质优化提供了依据。Young 等[29]构建了虹鳟Oncorhynchus mykiss 遗传连锁图谱，利用476 个AFLP 分子标记进行了遗传连锁分析，得到主连锁群32 个，小连锁群11 个。佟广香等[30]报道了利用AFLP 技术检测了转基因鲤Cyprinus carpio，证明了与生态安全直接相关的是转基因鲤逃逸的数量。闫学春等[16]报道了通过AFLP 的检测与分析，验证了河蟹Eriocheir sinensi 总DNA 可通过显微介导方式整合到镜鲤基因组中，这与本研究结果一致。本研究建立了显微介导鳜基因镜鲤的AFLP 反应体系，适合本研究显微介导鳜基因镜鲤的鉴定，其原理是先通过限制性内切酶将显微介导鳜基因镜鲤的基因组DNA 双酶切后，再通过将特定的接头链接在其分子量大小不等的限制性酶切片段的两端，对链接有特定接头的片段进行扩增，先进行预扩增，再进行选择扩增，因变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率较高，所以对选择性扩增产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，通过条带的多少，而获得DNA 的多态性，进而寻找实验所需要的特异条带，再通过电泳图谱查找是否含有供体基因片段。如果有供体基因片段，就证明了受体基因组中已成功整合了供体基因片段，其结果证明了AFLP 方法是检测显微介导鳜基因镜鲤的有效工具[31，32]。

利用显微介导远缘杂交技术，将异源DNA 直接导入鱼类进行分子育种，可以丰富鱼类遗传基础，扩大变异类型，将传统育种中难以利用的远缘基因转移，为传统育种提供新的种质，对鱼类育种工作有实践意义[33，34]。镜鲤和鳜在分类学上属于两个不同目，亲缘关系较远的物种，通过常规的育种方法很难进行杂交，主要受生物种间隔离限制而显示了其不可回避的局限性，但通过显微介导的方式将鳜基因组DNA 导入受体镜鲤基因组中，可以克服常规杂交选育方法中各种杂交不亲和性障碍，因此，显微介导远缘杂交技术在创造鱼类新品种、新类型方面存在着巨大的应用前景。而利用鳜良好的遗传资源，再结合显微介导的远缘杂交技术，将这些有益的基因导入受体鱼中，就有可能实现对受体鱼的改良。本研究通过AFLP 指纹图谱分析，在显微介导鳜基因镜鲤中检测到了鳜的特异片段，这从DNA 水平上证实了鳜的部分基因片段已渗入到显微介导鳜基因镜鲤亲本基因组中，说明了鳜总DNA导入受体镜鲤获得成功。转基因是随机插入，至于是哪部分基因插入到受体基因组中，发挥着什么作用，还有待进一步研究。本研究是两个基因组之间的杂交，尽管所渗入的供体基因组基因没有转目标基因那么明确，但只要能使受体亲本的目标性状达到改良的目的，就对鲤科鱼类的肌肉品质改良具有重要有意义[13]。