不同产地姜黄甲醇和石油醚部位化学成分的比较分析

方旖旎 王雅丽 陈惠琴 戴好富 关亚丽

摘 要 目的：比較不同产地姜黄甲醇和石油醚部位化学成分的差异。方法：采用超声法提取7个不同产地（S1～S7）姜黄并萃取得甲醇和石油醚部位，计算其得率。采用液质联用法测定甲醇部位中的姜黄素类化合物;采用气质联用法分析石油醚部位中的化学成分，通过与NIST 2005、Wiley275标准质谱图进行对比确定其结构，采用峰面积归一化法测定其相对百分含量;采用SPSS 25.0软件对不同产地姜黄石油醚部位中共有成分的相对百分含量进行主成分分析和聚类分析，同时分析不同产地所在纬度对总姜黄酮（以芳香-姜黄酮和姜黄酮计）含量的影响。结果：7个不同产地姜黄中甲醇部位的得率为1.35%～8.90%，石油醚部位的得率为0.81%～4.90%，最高均为福建龙岩。S1、S3～S7等地姜黄中姜黄素类化合物含量（参考峰面积）无显著差异，且含量均为姜黄素>去甲氧基姜黄>双去甲氧基姜黄素;S2产姜黄中姜黄素类化合物略有不同，主要表现为双去甲氧基姜黄素的含量比其他产地更高。不同产地姜黄石油醚部位共鉴定出47种化学成分，主要为倍半萜和单萜类化合物，其中S1～S7姜黄中分别鉴定出23、10、15、18、11、14、 15 种，总相对百分含量分别为94.49%、96.09%、95.66%、98.98%、99.24%、89.05%、97.27%;不同产地有4种共有成分，为姜黄酮（17.90%～43.07%）、芳香-姜黄酮（6.97%～33.66%）、（6R，7R）-红没药烯（1.60%～4.28%）、姜黄新酮（6.80%～20.63%）;主成分分析结果显示，姜黄中前6个主成分的累计方差贡献率为100%;聚类分析结果显示，S1、S2、S6各聚为一类，其他聚为一类。总姜黄酮含量随着纬度的升高呈先下降后升高的趋势且以四川绵阳最高（64.28%）、福建漳州最低（26.92%）。结论：不同产地姜黄甲醇部位姜黄素类成分及含量、石油醚部位成分及含量存在差异。

关键词 姜黄;产地;液质联用法;气质联用法;甲醇部位;石油醚部位;成分;含量

ABSTRACT   OBJECTIVE： To compare the chemical composition difference in methanol and petroleum ether fraction from Curcuma longa of different habitats. METHODS： The ultrasonic method was used to extract C. longa from 7 defferent producingareas （S1-S7）， and methanol and petroleum ether fraction were obtained and calculated yield. The curcumin compounds in methanol fraction were determined by LC-MS; The chemical components in petroleum ether fraction were analyzed by GC-MS， and the relative percentage content was determined by peak area normalization method after determining its structure by comparing NIST 2005 standard mass spectra and Wiley 275 standard mass spectra. SPSS 25.0 software was used for principle component analysis （PCA） and cluster analysis of relative percentage content of common components in petroleum ether fraction from C. longa of different habitats. At the same time， the influence of latitude of the habitats on the content of total tumerone （by tumerone and ar-tumerone）was analyzed. RESULTS： The yield of methanol fraction were 1.35%-8.90% from C. longa of 7 habitats; the yield of petroleum ether fraction were 0.81%-4.90%， which were the highest in C. longa from Longyan of Fujian Province. There was no significant difference in the relative content of curcumin compounds （reference peak area） from S1， S3-S7， which was in descending order as follows as curcumin>desmethoxycurcumin>bisdemethoxycurcumin. There was slightly different in curcumin compounds of C. longa from S2， mainly manifesting as the content of bisdemethoxycurcumin was higher than that from other producing areas. Totally 48 chemical compositions were identified from petroleum ether fraction in C. longa from different habitats， mainly being sesquiterpenoids and monoterpenoids. 23， 10， 15， 18， 11， 14， 15 chemical compositions were identified from S1-S7， accounting for 94.49%， 96.09%， 95.66%， 98.98%， 99.24%， 89.05% and 97.27%. There were 4 common compositions in C. longa from different habitats， which were tumerone （17.90%-43.07%）， ar-tumerone （6.97%-33.66%）， （6R，7R）-bisabolone （1.60%-4.28%）， curlone （6.80%-20.63%）. PCA analysis showed that accumulative contribution rate of former 6 principle components was 100%. Cluster analysis showed that S1，S2， S6 was clustered into a category， respecrively; and others into a category. Total content of total tumerone decreased first and then increased as the increase of latitude， which was the highest in Mianyang of Sichuan province （64.28%） and the lowest in Zhangzhou of Fujian province （26.92%）. CONCLUSIONS： There are difference in composition and content of methanol and petroleum ether fractions in C. longa from different habitats.

KEYWORDS   Curcuma longa; Producing areas; LC-MS; GC-MS; Methanol fraction; Petroleum ether fraction; Composition;Content

姜黄为姜科多年生草本植物姜黄（Curcuma longa L.）的干燥根茎，冬季茎叶枯萎时采挖，洗净，煮或蒸至透心，晒干，除去须根。该药原产于印度，于公元700年傳到我国[1]，并于2015年被列入药食同源名单[2]，主产于我国四川、广东、海南、云南、福建、台湾等地[3]。该药味苦、辛，性温，归脾、肝经，具有破血行气，通经止痛等功效，主要用于治疗胸胁刺痛、胸痹心痛、痛经经闭、癥瘕、风湿肩臂疼痛、跌扑肿痛等症[4]。现代研究表明，姜黄中主要含有姜黄素类和挥发油类化合物，其中姜黄素类化合物包括姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素[5-6]。药理研究表明，姜黄具有抗氧化、抗炎、保肝利胆、降血脂、抗艾滋病病毒、抗肿瘤、抗糖尿病等作用[7-8]。目前，市场上已有多种以姜黄为主要成分的中成药、保健品、食品、护肤品等。因受年均气温、极端气温和根际土壤有机物质含量等环境因素的影响，使得不同产地姜黄所含化学成分及含量存在差异，从而导致药效有所不同[9]。因此，比较不同产地姜黄甲醇部位（含姜黄素类化合物）和石油醚部位（含挥发油类化合物）的差异对药材的选择和深入开发具有重要意义。羊青等[10]只收集了海南和四川等地的姜黄进行检测，唐宜轩等[11]只收集了云南、广东、四川等地的姜黄进行检测，考察范围有限。基于此，本研究采用超声法提取了广东、四川、福建、云南、海南等不同产地姜黄并萃取得甲醇、石油醚部位;同时，采用液质联用法（LC-MS）分析甲醇部位的化学成分，采用气质联用法（GC-MS）分析石油醚部位的化学成分，并比较其差异，以期为其质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Amazon SL型MS仪（德国Bruker公司）;UltiMate 3000型高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司];5977E型GC-MS仪[安捷伦科技（中国）有限公司];SB-5200D型超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）;RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;CA-1111型冷却水循环装置[埃朗科技国际贸易（上海）有限公司]。

1.2 药品与试剂

7批姜黄药材样品（编号：S1～S7）经海南师范大学生命科学学院关亚丽副教授鉴定均为姜黄（C. longa L.）的根茎，其信息来源见表1。姜黄素对照品（批号：DST180111-014，纯度：≥98%）、去甲氧基姜黄素对照品（批号：DST181220-030，纯度：≥98%）、双去甲氧基姜黄素对照品（批号：DST181220-021，纯度：≥98%）均购自成都德斯特生物技术有限公司;石油醚（60～90 ℃）、乙醇为分析纯，甲醇为色谱纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 姜黄甲醇和石油醚部位的制备

取姜黄药材样品洗净切片，于70 ℃鼓风干燥至恒定质量。精密称取1 g，置于50 mL锥形瓶中，加入乙醇30 mL，超声（频率：40 kHz，功率：240 W，下同）处理35 min，滤过;重复超声提取3次，滤过，合并滤液。将滤液减压浓缩至干，得到乙醇提取物。将上述提取物加入95%甲醇10 mL溶解，置于125 mL分液漏斗中，加入等体积的石油醚萃取，重复3次，分别得到甲醇萃取物和石油醚萃取物，分别将上述萃取物减压浓缩至干，即得甲醇部位（橙黄色固体）和石油醚部位（黄色透明油状物），备用。

2.2 甲醇和石油醚部位得率的计算

按公式分别计算乙醇提取物和甲醇、石油醚部位的得率。得率（%）=提取物（或萃取物）质量/药材样品质量×100%[12]。 不同产地姜黄乙醇提取物和甲醇、石油醚部位得率见表2。由表2可知，广东湛江（S1）和福建龙岩（S4）姜黄甲醇部位得率较高，分别为8.30%、8.90%，且较接近;海南儋州（S6）甲醇部位得率最低（1.35%）;提示不同产地姜黄甲醇部位含量存在较大差异。福建龙岩（S4）姜黄石油醚部位得率最高（4.90%），海南儋州（S6）姜黄石油醚部位得率最低（0.81%）;提示不同产地姜黄石油醚部位含量亦存在较大差异。

2.3 LC-MS条件

2.3.1 LC条件 色谱柱：Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～45 min，10%B→100%B;45～50 min，100%B）;柱温：30 ℃;检测波长：254 nm;进样量：10 μL。

2.3.2 MS条件 参考文献[13]设置。离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描;扫描模式：多反应监测扫描模式;喷雾电压：4.5 kV;毛细管温度：350 ℃;吹扫气压力：137.9 kPa;辅助气流速：10 mL/min;扫描范围：m/z 100～1 000;二级质谱碰撞能量（CID）：20 eV。

2.4 GC-MS条件

2.4.1 GC条件 色谱柱：HP25MS型5%苯甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;载气：高纯氦气;载气流速：1.0 mL/min;进样口温度：260 ℃，程序升温（初始柱温60 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至250 ℃保持10 min）;总运行时间：31 min;分流进样，分流比：50 ∶ 1;进样量：10 μL。

2.4.2 MS条件 参考文献[14]设置。离子源：电子轰击离子源（EI）;电离能量：70 eV;离子源温度：230 ℃;四极杆温度：150 ℃;扫描范围：m/z 30～550;电子倍增器电压：1.917 kV。

2.5 LC-MS分析结果

2.5.1 对照品的LC-MS分析 将姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素对照品用甲醇溶解、稀释，制成质量浓度均为20 mg/mL的对照品溶液，进样分析，结果见图1。由图1可知，m/z 369.6的离子峰为姜黄素[M+H]+的离子峰，其相对分子量为368.38;m/z 339.7的离子峰为去甲氧基姜黄素[M+H]+的离子峰，其相对分子量为338.35;m/z 309.4的离子峰为双去甲氧基姜黄素[M+H]+的离子峰，其相对分子质量为308.33。

2.5.2 姜黄甲醇部位的LC-MS分析 取不同产地姜黄甲醇部位，用甲醇适量稀释，按“2.3”项下LC-MS条件进样测定，结果见图2。由图2与图1对比可知，广东湛江（S1）、福建漳州（S3）、福建龙岩（S4）、云南红河（S5）、海南儋州（S6）、台湾台南（S7）产姜黄中姜黄素类化合物的色谱图接近，均含有姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素，且含量（参考峰面积）均为姜黄素>去甲氧基姜黄>双去甲氧基姜黄素;四川绵阳（S2）产姜黄中姜黄素类化合物的色谱图略有不同，去甲氧基姜黄素含量与双去甲氧基姜黄素相当，且双去甲氧基姜黄素的含量相对其他产地更高。

2.6 GC-MS分析结果

取不同产地姜黄石油醚部位，用石油醚适量稀释，按“2.4”项下GC-MS条件进样测定，结果见图3。根据GC-MS得到的质谱信息，参考相对保留时间并通过与NIST2005、Wiley275标准质谱图进行对比，确定各组成成分;采用峰面积归一化法计算各成分相对百分含量，结果见表3。由表3可知，本研究从7个产地姜黄石油醚部位中共鉴定出47种化合物，主要为倍半萜和单萜类化合物。其中，广东湛江（S1）样品共鉴定出23种、四川绵阳（S2）10种、福建漳州（S3）15种、福建龙岩（S4）18种、云南红河（S5）11种、海南儋州（S6）14种、台湾台南（S7）15种，总相对百分含量分别为94.49%、96.09%、95.66%、98.98%、99.24%、89.05%和97.27%;7个产地姜黄共有成分4个，分别为姜黄酮、芳香-姜黄酮、姜黄新酮和（6R，7R）-红没药烯。

2.7 主成分分析

采用SPSS 25.0软件对不同产地姜黄石油醚部位的47种成分的相对百分含量进行主成分分析。各成分相对百分含量数据经标准化后，以特征值大于或等于1为标准，得到前6个主成分，其特征值和贡献率见表 4。由表4可知，前6个主成分的累积方差贡献率为100%，能够反映样品的整体信息。各特征向量挥发性成分相对百分含量数据通过SPSS 25.0軟件标准化后，计算各主成分综合得分，综合得分=（31.583×F1+28.041×F2+16.177×F3+11.772×F4+6.937×F5+5.490×F6）/100（式中，F1～F6表示1～6个主成分得分），结果见表5。

2.8 聚类分析

采用SPSS 25.0软件，借助组间联结聚类法以平方欧氏距离为测度，对不同产地姜黄石油醚部位进行聚类分析，结果见图4。由图4可知，7批姜黄样品可聚为4类，其中S1、S2、S6各聚为一类，其他聚为一类。可见，聚类分析结果与产地并不相同。同时，结合表3发现，S3～S5、S7姜黄石油醚部位共有成分8种，且均占总相对百分含量的70%以上。

2.9 纬度对姜黄中总姜黄酮含量的影响

本研究采收的不同产地姜黄有一定的纬度差异，最低为N19°52′，最高为N31°47′。以芳香-姜黄酮和姜黄酮的相对百分含量计为总姜黄酮含量，纬度对姜黄中总姜黄酮含量的影响见表6。总姜黄酮是姜黄的特征性成分[10]，不同产地姜黄中总姜黄酮相对百分含量最大值约为64.28%，最小值约为26.92%，约相差2.4倍，提示不同产地姜黄中的总姜黄酮含量存在差异，且总姜黄酮含量随着纬度升高而呈先下降后升高的趋势。

3 讨论

姜黄素类化合物和姜黄酮类化合物是姜黄的特征性成分，是姜黄的次生代谢产物[10]。次生代谢产物受多个基因控制，极易受自然条件的影响[15]。由于长期适应各自原产地的气候特点，故不同产地的姜黄形成了各自固有的遗传性（基因型）[9]。本研究结果发现，姜黄中总姜黄酮的含量随着纬度的增加呈先下降后升高趋势。纬度主要是通过影响地区的温度和光照来使得植物生理生态过程发生变化，进而改变植物中活性物质的合成过程及最终含量[16]。因此，笔者推测产地的年均气温、极端气温、日照时长、年降水量等因素可能会对姜黄的品质造成影响，但尚有待于进一步研究。

本研究采用超声法提取7个不同产地的姜黄并萃取得甲醇和石油醚部位。通过LC-MS法检测甲醇部位的姜黄素类化合物的含量，通过GC-MS法检测石油醚部位的成分和相对百分含量。结果，不同产地的姜黄甲醇和石油醚部位的成分和含量均存在一定的差异。陈福北等[6]采用GC-MS法对比了水蒸气蒸馏法和以石油醚为溶剂的索氏提取法提取干、生两种姜黄的挥发性成分，共鉴定出25种化合物。与上述研究相比，本研究中未鉴定出棕榈酸乙酯等化合物。羊青等[10]采用GC-MS法分析对比了水蒸气蒸馏法提取的四川、海南、泰国和越南产姜黄挥发油成分，共鉴定出50种成分。与上述研究相比，本研究未鉴定出β-雪松烯、对伞花烃等化合物。但本研究首次鉴定出了1-（1，5-二甲基-4-己烯基）-4-甲基苯、[S-（R*，S*）]-3-（1，5-二甲基-4-己烯基）-6-亚甲基-环己烯、（1R，4R）-1-甲基-4-（6-甲基庚-5-烯-2-基）环己-2-烯醇等化合物。由此笔者推测造成姜黄成分差异的原因除了产地因素外，还可能与贮存方式、提取方法、检测条件等有关，其具体原因有待深入研究。

本研究中主成分分析综合得分排名显示，产自广东湛江的姜黄品质较好;聚类分析结果显示，产自福建、云南红河和台湾台南的姜黄化学成分和含量接近，猜测其可能属于同一栽培种。

综上所述，不同产地姜黄的甲醇部位含量、石油醚部位成分及含量存在差异。

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（收稿日期：2020-04-23 修回日期：2020-07-05）

（编辑：陈 宏）