无透镜全息显微细胞成像

王 雪,刘虹遥,路鑫超*，孙旭晴，叶一霏，黄成军*

(1.中国科学院 微电子研究所，北京 100029；2.中国科学院大学，北京 100049)

1 引 言

光学显微镜是人们观察微观世界的重要工具。传统的光学显微成像系统一般由光源、多个透镜及图像传感器等多个部件组成，结构复杂、价格昂贵。由于受到物镜固定空间带宽积的限制，显微镜往往无法同时满足高分辨率成像和大成像视场的需求[1]。以生物医学显微成像为例，为了获得高分辨率、大视场显微图像，需要将许多小视场图像进行拼接，因此必须对图像进行预处理，图像的配准和融合通常存在准确性低、耗时长等问题[2-3]。

近年来，随着光电图像传感器件的发展以及图像处理技术的进步，一种新型的显微成像技术——无透镜成像技术得到了迅速发展。该技术不仅克服了传统光学显微镜空间带宽积的限制，无球差、彗差等光学透镜带来的像差，而且具有结构简单、便携性高和成本低等优点[4-7]。目前，无透镜成像技术主要有无透镜阴影成像[8]、无透镜荧光成像[9]和无透镜全息成像[6]三种。其中，无透镜全息成像技术不需要对样品进行特殊处理，且分辨率高，因此最具应用前景。无透镜全息显微成像系统的硬件部分通常由一个部分相干LED光源、一个针孔或光纤和一个光电探测器(CCD或者CMOS)组成。在成像过程中，来自LED的光经过针孔或光纤传播一段距离后，照射到样品上，样品透过光的衍射图样被光电探测器记录，然后使用图像恢复算法处理样品的全息图，最终得到样品的显微放大图像[4,7,10]。为了快速地重构出样品的高分辨率复值图像，研究人员设计了多种数字图像重建算法，例如改进的GS算法[11]、混合输入输出算法(HIO)[12]、多图像相位恢复算法[13]及深度学习算法[14]等。目前，无透镜全息显微镜可以在20～30 mm2的成像视场下实现亚微米量级的分辨率极限。

本文搭建了一套无透镜全息显微成像系统，该系统由中心波长为595 nm的窄带LED光源、直径为50 μm的针孔和单像素尺寸为2.2 μm、500万像素、视场为24.5 mm2的板式相机组成，并开发了相应的图像恢复算法。该系统成功实现了对具有亚微米级图形的测试靶和实验室培养的肺癌细胞H1299的显微成像，在生物医学领域具有广阔的应用前景。

2 成像原理与实验系统

2.1 成像原理及参数优化

全息无透镜显微成像系统原理如图1所示，主要包括中心波长λ=595 nm的LED光源、直径D=50 μm的精密针孔、被测样品与CMOS图像传感器。针孔与被测样品的距离为Z1，被测物与CMOS图像传感器的距离为Z2。使用针孔可提高出射光的相干度，在距离Z1满足一定条件时，照射到样品上的光近似为相干光。使用二维移动平台搭载被测样品，透过样品的光可以分为两部分，一部分是经过样品的光，称为物光；一部分是透过样品基底但没有经过样品的光，称为参考光。这两部分光在透过样品后相互干涉，形成的干涉图案被CMOS图像传感器记录。

图1 无透镜全息显微成像系统示意图Fig.1 Schematic diagram of lens-free holographic microscopy system

在Gabor全息图的制作过程中，为了得到干涉全息图，一般需要使用相干光照射目标物体。本文使用的是部分相干光源，为使得从小孔出来的光到达样品面处具有高度的相干性，该无透镜全息成像系统需要满足一定的参数设置[15]。由范西特-泽尼克定理，可以求得光源尺寸、传播距离和相干照明面积之间的关系[16]。如图2所示，如果光源的线性尺度和像面上的两点P1和P2的间距L比光源到像面的距离小得多，则像面上的两点P1和P2的相干度∣j12∣等于光源强度函数的归一化傅里叶变换的绝对值，即有:

(1)

(2)

(3)

式(3)说明，对于半径为ρ的圆形非相干光源，S处的平行平面上P1P2两点若要保持高的相干度所需要满足的关系。在本文中，由于针孔的作用，可以将从直径为50 μm的针孔出射的部分相干光视为光源，将一定距离外5.7 mm×4.3 mm的CMOS图像传感器视为接收面。针对本文所搭建的无透镜全息成像系统，ρ=25 μm，λ=595 nm。为得到清晰的全息图像，在光强足够，且保证在感光面上距离为P1P2的两点具有高度的相干性，这里取光源到感光面的距离S为20 cm，使得样品平面所在的位置对应的相干长度P1P2约为762 μm，远大于成像目标的特征尺寸，因此可以得到清晰的干涉图样。

图2 范西特-泽尼克定理几何布局示意图Fig.2 Geometric layout of Van Cittert-Zernike theorem

2.2 全息图像恢复算法设计

全息图像恢复的基本原理是通过设计算法模拟光学衍射的过程，主要算法有菲涅尔衍射法、卷积法和角谱法。相较于菲涅尔衍射法和卷积法，角谱法的优势在于恢复像的大小与衍射距离和波长无关，使用仅一次傅里叶变换和一次傅里叶逆变换就可以实现图像恢复，因此，在本文中使用角谱法算法实现全息图像恢复。

(4)

(5)

因此，物平面上的光波U(x0,y0,0)和像平面上的光波U(x,y,z)的关系可以用如下傅里叶变换描述:

(6)

图3 图像重建流程Fig.3 Flow chart of image reconstruction

利用本文中所搭建的全息无透镜成像系统进行图像的采集和恢复，流程如图3所示。从光源发出的光照射到样品上，其中一部分光透过样品，另一部分光透过载玻片上没有样品的部分，透过载玻片后两部分光继续向前衍射传播，由CMOS记录下在其表面产生的干涉全息图。如图4(a)所示，在全息图重建过程中，首先将全息图进行傅里叶变换得到相应的频谱图，如图4(b)所示。物平面和像平面的距离Z2记为图像的重建距离，相应的传输函数为HZ，然后对图像进行逆傅里叶变换，得到重建目标图像，如图4(c)所示。其中重建距离Z2对恢复图像的质量有明显的影响，为了获得高质量的重建图像，对Z2选取多组数值重建同一目标物体，通过比较重建图像的清晰度来确定最佳重建距离。该重建方式简单便捷，特别适合于较大尺寸样品(如数微米到数十微米量级)的显微成像。

图4 (a)成像目标的全息图；(b)全息图的傅里叶频谱；(c)重建的目标图像Fig.4 (a) Hologram of object;(b) Fourier spectrum of hologram;(c) Reconstructed target image

3 实验结果与讨论

图5 无透镜全息显微成像系统装置Fig.5 Photo of lensfree imaging setup

图5为本文所搭建的全息无透镜显微成像系统，选用中心波长λ=595 nm的部分相干LED光源，与直径D=50 μm的精密针孔，光源和针孔通过同轴机械件连接，成像面为单像素尺寸为2.2 μm、500万像素、视场为5.7 mm×4.3 mm的CMOS图像传感器，针孔到样品的距离Z1=20 cm，样品到CMOS的距离Z2≈1 mm。

本文首先选取具有微米级图案的分辨率测试靶(型号：USAF1951)作为样品，对它进行显微成像，通过观察分辨率靶中能分辨的最小线对，就可以获得该无透镜全息显微成像系统可以达到的分辨率极限。图6(a)～6(c)为CMOS图像传感器采集到的分辨率测试靶的全息图像，图6(a)是全息图的全尺寸图像，图6(b)和6(c)是分辨率靶的逐级局部放大图。

图6 (a)～(c)分辨率测试靶的全息图像和局部放大图；(d)～(f)对应(a)～(c)的恢复重建图像Fig.6 (a)～(c) Hologram and local enlarged images of resolution test target;(d)～(f)Reconstructed images corresponding to (a)～(c)

重建后的图像如图6(d)～6(f)所示，重建距离为1 mm，取分辨率靶上第6组的第5，6线对，沿垂直线对方向提取强度变化曲线，结果如图7(a)和图7(b)所示。重建后的图像可以分辨出分辨率靶上第6组的第6线对，其中，纵坐标为像素数，单像素尺寸为2.2 μm，图像分辨率极限达到4.4 μm。

图7 (a)和(b)分别对应图6(f)中分辨率靶上第6组的第5，6线对的强度值沿横向变化的曲线Fig.7 (a) and (b) correspond to the transverse intensity value change curve of line 5 and line 6 in group 6 of test target in Fig.6 (b), respectively

在上述研究结果的基础上，本文进一步对生物样品——肺癌H1299细胞进行全息无透镜显微成像研究。细胞悬浮液(RPMI-1640+10% FBS+1%双抗)中培养的肺癌H1299细胞，在传统显微镜(显微镜型号：Olympus IX73)下近似为球形，典型细胞直径为10～20 μm。实验中，将细胞培养液(细胞浓度约为104细胞/毫升)滴加到全息无透镜显微成像系统中的CMOS图像传感器上方的载玻片上，形成一层厚度在几百微米的液膜。图8(a)为通过无透镜全息显微成像系统采集到的样品的全息图，图8(b)是局部放大图，可以看到细胞在全息图上的分布，通过截取图8(b)中两处局部进一步放大，可以更清楚地看到单个或重叠的细胞的干涉全息图。图8(c)所示是经过图像恢复算法得到的细胞样品的显微放大图像，两处局部放大图对应图8(b)中的样品两处局部放大的相同位置，更清楚地展示了重建图像中细胞的形貌，可以观察到重建后的单个细胞以及紧贴粘连在一起的多个细胞。图9是与图8相对应的肺癌细胞的相位图，两幅插图展示了相应的单个细胞和多个粘连在一起的多个细胞的形貌。与强度重建图相比，在相位图中细胞的轮廓明显的比中心亮，更有利于识别细胞的形貌。

图8 (a)肺癌细胞的全息图；(b)是(a)图的局部放大图；(c)是与(b)图对应的重建的肺癌细胞图像Fig.8 (a) Hologram of lung cancer cells;(b) Partial enlarged view of Fig. (a);(c) Reconstructed lung cancer cells image corresponding to Fig. (b)

图9 (a)肺癌细胞的重建相位;(b)是(a)图的局部放大图，插图为图8中对应的细胞的相位图Fig.9 (a) Phase image of lung cancer cells;(b) Partial enlarged view of Fig. (a), Two insets are phase images of corresponding cells in Fig.8

上述两组实验表明了该全息无透镜显微成像系统的成像能力，得到了图像分辨率极限为4.4 μm和成像视野达24.5 mm2的成像结果，清晰地观察到了实验室培养的肺癌细胞。但是受到孪生像的干扰，成像的清晰度和分辨率有待进一步提高，这个问题在将来的研究中有望通过使用多距离相位恢复算法等手段得到解决。

4 结 论

本文基于全息无透镜显微成像的重建原理和自主搭建的无透镜全息显微成像光学系统，实现了对美国空军USAF1951分辨率测试靶和实验室培养的肺癌细胞的大视场显微成像，成像视场为5.7 mm×4.3 mm，重建图像的分辨率极限为4.4 μm。全息无透镜显微成像系统结构简单、成像视场大，成像过程能够数字化处理，结合数字图像处理技术可以实现对样品的高速成像，并进行计数和识别，在发展高通量、自动化的便携式显微成像设备方面有巨大的潜力。该技术未来可应用在食品安全如病原性大肠杆菌检测、水环境中致病微生物和颗粒物检测及远程医疗等领域。