人乳头瘤病毒核酸分型定量检测试剂盒的研发与评估

张蓉

（江苏硕世生物科技股份有限公司上海分公司，上海201114）

宫颈癌是女性第二常见的恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，也是目前唯一一个病因明确的恶性肿瘤[1]。根据世界卫生组织统计，在全球范围内，2018 年估计有57 万例新病例，占所有女性癌症死亡人数的7.5%。每年估计超过31.1 万例死于宫颈癌，超过85%发生在欠发达地区[2]。在发达国家，女性可以接受针对人乳头瘤病毒的疫苗接种，并可以对妇女进行定期筛查，在易于治疗的阶段识别出癌前病变。因此可以大大降低宫颈癌的发生。人乳头瘤病毒（HPV）是一种主要存在于人皮肤、黏膜及女性宫颈上皮细胞异形区的病毒。1995 年国际癌症研究机构（IARC）正式宣布HPV 某些型别持续性感染是导致宫颈癌的最主要因素。WHO 把与宫颈癌发生有关的HPV 型别称为高危型，有HPV 16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82等；与肿瘤不相关的称为低危型，最常见的为HPV 6, 11 和81等。研究提示在宫颈癌的发生中16、18 等高危型的致癌性远远高于其他型别[3-4]。美国阴道镜和宫颈病理学会将16 和18 型阳性列为病理学检测指症。病毒载量被认为是中度宫颈上皮内瘤变（CINⅡ）或更高级别的宫颈上皮内瘤变的潜在生物指征。本研究开发一个试剂盒，用于研究HPV 型别及载量在临床上的应用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 临床样本及参考品

因暂无人乳头状瘤病毒体外培养技术，本研究采用HPV16型国际标准品、宫颈腺癌细胞Hela 细胞、鳞癌细胞Siha、重组HPV 质粒及临床样本等进行性能评估。采用的样本来源于2011.07～2013.12 期间临床医疗机构收集的宫颈脱落细胞剩余样本。

1.1.2 仪器

SLAN-96P 荧光定量PCR 仪购买自上海宏石医疗科技有限公司。

1.1.3 试剂

人乳头瘤病毒核酸分型定量检测试剂盒（荧光PCR 法）自主研发，采用实时荧光PCR 技术，主要以HPV L1 区为靶区域，可一次性检测21 种常见HPV 高、中、低危型及取样细胞数，并通过参考基因与待测细胞的线性关系获得HPV16 型在单位细胞中的载量。

1.2 方法

1.2.1 试剂性能验证

性能评估包括最低检测限、HPV 分型准确度、HPV16 型定量准确度、线性范围、特异性、精密度评价等。

a.最低检测限：采用阳性参考品进行梯度稀释确定本试剂盒的灵敏度。将一定浓度的HPV 阳性参考品进行10 倍倍比稀释，用于反应体系灵敏度的确定，当阳性检出率≥95%时的浓度即为试剂盒的最低检出限。另外，采用21 个HPV 国家标准品进行梯度稀释至最低检测限浓度（1×104copies/ml，等同于20copies/反应），重复检测20 次，以验证本试剂盒的最低检测限。

b.HPV 分型准确度：采用细胞系、20 个HPV 型别国家标准品和HPV68 型参考品对试剂盒的分型准确度进行评价。

c.定量准确度：采用HPV16 型国际标准品（1×107IU/ml）、人白细胞样本、HPV16 型定量参考品（浓度为104copies/mL，104个/mL 白细胞作为基质）分别对HPV16 型、参考基因以及HPV16型感染单位的定量准确性进行验证。以上量值进行测定后，按照B=M-T 公式（B- 绝对偏差；M- 测试结果均值；T- 参考物质标示值）进行计算。绝对偏差均不超过±0.5 个对数数量级为量值准确度的标准。

d.线性范围：分别对HPV16 型定量参考品和参考基因的线性范围进行研究，将1×1012copies/ml 浓度的HPV16 型、参考基因质粒分别进行梯度稀释，使用多项式回归分析判断校准曲线是否具有线性，根据R2大于0.995 从而判断本试剂盒的检测范围。

e.特异性验证：采用本研究试剂盒检测与人乳头瘤病毒感染部位相同、症状相似的病原体及于试剂盒检测范围之外的其它病原体来验证试剂盒的特异性，细菌的浓度为106cfu/ml，病毒的浓度为105pfu/ml，HPV 特异性型别的浓度为106copies/ml。检测宫颈脱落细胞样本中可能存在的干扰物质，具体组分和浓度如下表1。

表1 干扰物质及病原体

f. 精密度评价：采用精密性参考品对试剂盒进行精密度评估，每份参考品重复检测20 次。对荧光PCR 数据进行统计分析，评价批内、批间变异系数，要求变异系数CV 小于5%（定量采用浓度对数计算）。

1.2.2 临床试验

试验共采集2140 份样本进行本试剂盒的定性检测，其中508 份HPV16 型样本进行定量检测*。通过与 人乳头状瘤病毒(HPV)分型检测试剂盒(PCR+膜杂交法)）的一致性评价来确定试剂盒的有效性。另外，以病理或细胞学结果为金标准，进行HPV16 型定量结果的评价。将病理学结果按照宫颈癌的病变程度分为4 个等级：第1 组为未见上皮病变或恶性改变（NILM）；第2 组为低度鳞状上皮内病变（LSIL）；第3 组为高度鳞状上皮内病变（HSIL）；第4 组为癌症。观察不同病毒等级组间的差异，以病理等级为金标准，验证HPV16 型载量临床Cutoff 值（16600拷贝/10000 个细胞）的灵敏度和特异性。

注：*其中的一家中心817 份样本数据（包含313 例HPV16型，用于定量分析）已经发表在BMC Cancer[5]。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 进行统计学分析。计算计量资料的均数、方差、标准差和CV，以及临床一致性的阳性符合率、阴性符合率、总符合率、Kappa 值。

2 结果

2.1 试剂性能验证

2.1.1 最低检测限

本研究对反应体系的灵敏度进行验证，对实验结果进行统计分析，浓度为1×104copies/ml 的21 个HPV 国家标准品检出率分别都大于95%。因此本试剂盒反应体系的灵敏度确定为1×104copies/ml（20 copies/反应）。

2.1.2 HPV 分型准确度

检测以上参考品，阳性符合率和阴性符合率均为100%。

2.1.3 定量准确度

分别对HPV16 型定量准确度、参考基因定量准确度以及HPV16 型感染单位（拷贝数/10000 细胞）量值测定结果如下表2，实验结果表明，试剂盒对HPV16 型国际标准品、参考基因以及HPV16 型感染单位的浓度的绝对偏差均不超过±0.5 个对数数量级，符合试剂盒性能要求。

2.1.4 线性范围

确定HPV16 型的线性范围是1×1010copies/ml 至1×104copies/ml，参考基因的线性范围是5×109copies/ml 至2×103copies/ml，当处于以上浓度范围时，所有点都处于一条直线上，线性相关系数R2大于0.995。

2.1.5 特异性验证

与人乳头瘤病毒感染部位相同、症状相似的病原体及于试剂盒检测范围之外的其它病原体均无交叉。干扰物质研究时，经数据统计分析，实验组P 值均大于0.05，差异不显著，说明以上浓度干扰物质对试剂盒的分型和定量检测没有影响。

2.1.6 精密度评价

采用3 个批次试剂，验证试剂盒的批内和批间精密度，其变异系数CV 均小于5%。说明本研究试剂精密度较高。

2.2 临床对比评价结果

2.2.1 人乳头瘤病毒分型检测结果

在2140 例临床检测样本中，阳性样本数最多的前4 个型别分别是16 型（630 例）、52 型（423 例）、58 型（286 例）、18 型（217例）。对两种方法进行一致性评价，总体阳性符合率为91.2%，阴性符合率为98.2%，总符合率为97.7%，Kappa 值为0.823。其中HPV16、18、31、66、53、33、58、45、52、68、39、6、11 的检出结果一致性较好，kappa 系数均大于0.75(P＜0.05)。差异样本经基因测序验证，得知对于两种试剂盒结果中21 个型别不符的样本有944 例（同一样本有多型别不符按多个纳入统计），对照试剂的准确率为17.90%，本研究方法准确率为82.10%。一致性较低的HPV59、56、35、51、81，均为对照试剂漏检导致，因此可以明显看出本方法在分型方面灵敏度及准确率明显优于对照试剂。

2.2.2 HPV16 载量与病理等级的相关性

对508 例HPV16 样本的定量结果按照病理学等级进行分级，1-4 级的病毒感染单位中位数为2128（245 例）、45622.93（78例）、84721.2（115 例）、92846.35（70 例）。通过Wilcoxon 检验进行1 级与2-4 级间的差异性分析，结果P 值小于0.0001，表明病理等级在CINⅠ-Ⅱ以上（2-4 级）同病理检查正常、炎症间病毒感染量有显著性差异。

将HPV16 型样本的检测载量按产品的临床Cutoff 值划分为阳性和阴性，以病理结果为标准分析载量预测的效果。其灵敏度为72.62%，特异度为72.24%。HPV16 型定量检测通过cutoff值判定病理等级CINⅠ- Ⅱ及以上等级的准确率在72.44%（68.33%～76.28%），对临床诊断有一定辅助意义。

表2 定量准确度参数

3 讨论

就大多数患者而言，从感染到最终宫颈癌的发生存在一个缓慢的潜伏期，因此，及时定期检测宫颈脱落细胞中HPV 的有无及载量的变化在宫颈癌的早期筛查、辅助诊断和愈后评估等环节中显得尤为重要。本研究研制的“人乳头瘤病毒核酸分型定量检测试剂盒（荧光PCR 法）”采用荧光定量PCR 技术对适龄妇女进行宫颈癌的早期筛查，对HPV21 个型别进行核酸水平的分型和定量分析。从性能评价和临床验证结果可以看到试剂盒各项性能指标均符合要求，与临床已上市产品相比，HPV 型别检测的一致性较高。

而关于HPV 型别载量与宫颈疾病进程相关性一直是近年来研究的关注点，Kim J 等研究推测在HPV 16、18 和58 感染病例中，型别特异性病毒载量可能是一个强有力的HSIL+诊断指标，如果在所有其他高危HPV 型中也得到证实，病毒载量检测可能导致细胞学异常的诊断策略发生转变[6]。在HPV16 感染的患者中，病毒载量与高级别上皮内病变或宫颈癌相关，这可以作为肿瘤进展和宫颈癌筛查的有效预测生物标志物[7]，且研究提示于高病毒载量的患者，特定的随访可能有用[8]。本研究根据临床数据，也提示通过HPV16 型病毒载量预测病理等级CINⅠ-Ⅱ及以上等级的准确率在72.44%，病毒载量的测试可以用于疾病进程的分流中，具有一定的临床诊断意义。且本方法具有操作简单、快速、自动化程度高等特点，适合于临床HPV DNA 检查和大规模的样本筛查，为人乳头瘤病毒的快速筛查提供更有效的辅助手段。