糖胺聚糖降解菌株的筛选及鉴定

雷 曦， 周峻沛,2,3,4， 黄遵锡,2,3,4， 丁 琳， 张 蕊,2,3,4*

(1.云南师范大学 生命科学学院，云南 昆明 650500;2.生物能源持续开发利用教育部工程中心，云南 昆明 650500；3.云南省生物质能与环境生物技术重点实验室，云南 昆明 650500；4.云南师范大学 酶工程重点实验室，云南 昆明 650500)

糖胺聚糖(Glycosaminoglycans, GAG)，由己糖、己糖醛酸或己糖胺组成的重复二糖单元构成，是一类作为细胞骨架成分的大分子酸性直链多糖[1]。糖胺聚糖位于细胞表面和基质，常与蛋白质相互作用参与生物体内一系列重要的生理功能，如细胞增殖、分化、转移和识别等过程。但糖胺聚糖的结构复杂且多样，通常根据二糖单位的不同，可将糖胺聚糖分为透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素和硫酸乙酰肝素[2]。糖胺聚糖降解酶(Glycosaminoglycan degrading enzyme)是一类能够将大分子糖胺聚糖降解成寡糖及不饱和二糖的物质，主要来源于动物和微生物[3-5]。在医疗方面，临床常作为渗透剂，降解细胞基质间的透明质酸，提高组织通透性，从而加快注射药物的扩散和吸收[6]，糖胺聚糖降解酶也可用于治疗心肌梗死、肿瘤、牙周炎以及一些眼科疾病[7-9]。在食品方面，该酶的降解产物糖胺寡糖可作为食品或保健品，具有促进血管生成和创伤愈合的作用[10-11]。在工业生产方面，糖胺聚糖降解酶可替代传统石灰浸灰松散动物皮革，改进制革工艺，降低制革过程对环境的污染[12]。目前，可利用的糖胺聚糖降解酶的数量有限，市售的糖胺聚糖降解酶价格昂贵，远远不能满足医疗、食品和其他工业的需求。糖胺聚糖降解酶根据降解底物特异性分为透明质酸酶(Hyaluronidase)、硫酸软骨素酶(Chondroitinase)和肝素酶(Heparinase)等。多数微生物来源糖胺聚糖降解酶可同时降解透明质酸和硫酸软骨素[6]。微生物来源酶具有产量高、活力强、性质多样、易于异源重组表达等特点，是工业酶制剂的主要研究对象。而土壤细菌作为最重要的土壤生态系统部分，数量庞大且种类丰富，在分解有机物、矿物质以及生产各种各样功能酶和其他产物等方面发挥着重要作用[13]。因此，从生物多样性较高的土壤中筛选具有糖胺聚糖降解酶活性的菌株有着重要的理论和应用的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤采集 选择有机物质丰富且尽量是有动物栖息的地区作为土壤样品采集地点，取土壤表层以下2～8 cm的土样约200 g，置冰运输。材料来源于云南省西双版纳、玉溪、普洱、红河、丽江、昆明等地的土壤和淤泥。

1.1.2 培养基(g/L) ①富集培养基：(NH4)2SO410，NaCl 5，硫酸软骨素(CS) 2，透明质酸(HA) 2；②筛选培养基：脑心浸液肉汤(BHI) 38.5，琼脂 20，硫酸软骨素 2，透明质酸 2；③纯化培养基：脑心浸液肉汤(BHI) 38.5，琼脂 20。

1.1.3 试剂 BSA-乙酸溶液：100 g/L牛血清白蛋白Ⅴ组份与乙酸4∶1混合；氯化钠；硫酸软骨素；透明质酸钠；柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液：0.2 mol/L柠檬酸+0.2 mol/L磷酸氢二钠；DNS终止液；细胞裂解液；琼脂糖；TBE电泳缓冲液。

1.1.4 仪器与设备 恒温培养箱(DHP9052，上海一恒科学仪器有限公司)；震荡培养箱(ZQWY-200N，上海知楚仪器有限公司)；系列酶标分析仪(HBS-1096，南京德铁实验设备有限公司)；水浴锅(DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司)；PCR仪(ETC-811，苏州东胜兴业科学仪器有限公司)；便携式pH计(梅特勒-托利多仪器公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；核酸电泳仪(美国Bio-Rad公司)；超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；电子天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 方法

1.2.1 土壤细菌的筛选 ①富集培养和分离：每份土壤称量约30 g倒入锥形瓶中，再加入100 mL无菌生理盐水溶液，充分摇晃使土壤散开后静置浸提1 h[14]。取1 mL土壤浸提液加入100 mL富集培养基中，160 r/min，37 ℃通风培养至富集培养基变浑浊(约60 h)。培养富集菌：在筛选培养基上划线分离，平板于37 ℃培养箱倒置培养直至出现明显单菌落，挑选形态不一的菌落并进一步在纯化培养基上划线分离。②糖胺聚糖降解菌株的初筛：BSA在酸性条件下可与GAG结合形成络合物沉淀，而使含GAG的固体培养基发生浊度反应，但是GAG若被菌落降解则无反应，因而有活性的菌落周围会产生透明圈，即为阳性反应，反之无透明圈则为阴性反应[15]。将平板上待筛选菌株编号并转接于650 μL的LB培养基中，37 ℃，160 r/min摇床培养6 h。加入3 mL BSA-乙酸混合液至平板中，左右倾斜至铺满平板，反应5～10 min，将BSA溶液倒掉，观察预先标记挑菌位置有无透明圈，记录产透明圈菌株。③糖胺聚糖降解菌株的复筛：初筛呈阳性的菌株接种于5 mL LB培养基中，160 r/min，37 ℃培养6 h后取2 mL转入200 mL LB发酵培养基中，180 r/min，37 ℃通风培养约15 h(培养至细菌发酵液在600 nm测量的OD值为0.65～0.75)。将发酵液在6 000 r/min，离心8 min，弃上清，沉淀用柠檬酸-磷酸氢二钠(pH 7.0)缓冲液重悬，超声破碎后12 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清得到粗酶。并用DNS法[16]检测酶活性，取450 μL底物(5 g/L透明质酸或5 g/L硫酸软骨素)加至试管中放入37 ℃水浴锅预热5 min，加入60 μL粗酶反应1 h后，加750 μL DNS终止液终止反应，空白组中先加入750 μL DNS终止液后再加60 μL酶液。最后将试管放入沸水浴中煮沸，透明质酸为底物时煮沸5 min，硫酸软骨素为底物时煮沸4 min。冷却后，测定540 nm的OD值，以市售的(索莱宝公司)糖胺聚糖酶(1 mg/mL)吸光值作为100%对照，计算粗酶的相对酶活。

1.2.2 糖胺聚糖降解菌株的16S rDNA鉴定 ①模板DNA提取[17]：复筛的菌株进行平板划线培养再分纯，接种针蘸取LB培养基中保存的菌液，平板划线放入37 ℃培养箱倒置培养15 h。用无菌牙签挑取平板划线分纯的单菌落，搅拌悬于30 μL细胞裂解液中，放入80 ℃金属浴15 min，裂解出细菌的总DNA后取出置冰箱备用。②PCR扩增16S rDNA：以提取的总DNA为模板，用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR扩增菌株的16S rDNA序列[18]。40 μL PCR反应体系中含有rTaq酶0.6 μL，模板DNA 2 μL，引物27F和1492R(20 μmol/L)各1 μL，10×Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，ddH2O 29.4 μL。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带，送阳性样品至擎科生物公司进行测序，测序结果经DNAman拼接后，在NCBI上进行BlastN比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。③16S rDNA系统进化树构建：用所有活性菌株16S rDNA序列构建系统进化树[19]。测序结果在Clustal X软件上进行多序列比对，根据Kimura双参数模型计算核苷酸的距离矩阵，再用MEGA 4.0软件的邻接算法构建系统发育树(bootstrap值为1 000)。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选结果

从83份土壤样品中共分离了418个菌株，初筛116株菌株出现透明圈呈现阳性反应，复筛13株菌株具有糖胺聚糖降解酶活力。糖胺聚糖降解菌株筛选结果见表1，7株来自西双版纳的土壤样品，2株来自普洱的土壤样品，1株来自玉溪的土壤样品，3株来自昆明的土壤样品。

用透明质酸(HA)和硫酸软骨素(CS)为底物，以索莱宝公司的糖胺聚糖酶(1 mg/mL)作标准对照(CK)，获得13株糖胺聚糖降解能力的菌株(图1)。筛选到13株菌株均具有降解透明质酸和硫酸软骨素能力。其中，多数菌株透明质酸酶活力高于硫酸软骨素的酶活力，菌株BN3-1的透明质酸酶的活性明显高于其他菌株。

表1 糖胺聚糖降解菌株筛选结果

图1 不同菌株的相对酶活Fig.1 Enzymatic activities of strains

2.2 16S rDNA鉴定结果

13株菌16S rDNA的PCR电泳结果显示单一明显条带，大小在1 500 bp左右。测序拼接后，将13株菌株16S rDNA序列分别与NCBI数据库中的核酸序列比对，BlastN比对结果汇总于表2。结果显示，与比对菌种同源性最高的菌株可能来自不同的科或不同的属，如B11-1与栖木假单胞菌(假单胞菌科假单胞菌属)和嗜麦芽窄食单胞菌(黄单胞菌科窄食单胞菌属)均具有99.86%最高一致性。因此，需要结合系统发育树的聚类分析，进一步对13株菌株鉴定分析。

分析同源性高的菌种中糖胺聚糖降解酶研究情况(表2)，蜡样芽胞杆菌(KM6-6最高一致性99.86%)和枯草芽胞杆菌(KM8-2最高一致性98.89%)来源的糖胺聚糖降解酶已有功能验证的研究；弗氏柠檬酸杆菌(BN3-1最高一致性98.86%)和沙门氏菌(BN3-1最高一致性98.74%)中发现了糖胺聚糖降解酶基因但未研究过其功能；而在蔗糖小迫氏菌、阴沟肠杆菌和成团泛菌等8株菌中还未发现糖胺聚糖降解酶基因以及酶功能研究的报导。

对13株菌株16S rDNA序列构建系统发育树分析(图2)。BN11-1与KM1-1(假单胞菌科假单胞菌属)位于同一进化分支上，亲缘关系近。因此，结合比对结果和系统进化树分析，BN11-1菌株应属于假单胞菌科假单胞菌属。有9株为肠杆菌科，BN1-3、BN18-1、BN20-2、BN24-5、PE2-1、BN3-3、YX11-5分别是肠杆菌属、Kosakonia属或拉乌尔菌属等，位于同一个进化分支，彼此亲缘关系近。BN3-1和PE5-2属于肠杆菌科的枸橼酸杆菌属、沙门氏菌属或西地西菌属等，位于另外一个进化分支，与上述7个菌种进化关系较远。

表2 活性菌株16S rDNA比对结果

图2 16S rDNA系统进化树Fig.2 The phylogenetic tree constructed on the basis of 16S rDNA sequences

3 讨 论

目前市售糖胺聚糖降解酶大都是从动物睾丸或卵巢中提取[22]，由于成本高，提取困难，导致价格昂贵。所以，现在研究的重点方向是微生物来源的糖胺聚糖酶，大部分研究的糖胺聚糖降解酶都来源于链球菌，酶活大约在几千至上万个单位每毫克[21]。因此，筛选产高活性糖胺聚糖降解酶的细菌很有必要。

本研究根据微生物产酶分解糖胺聚糖的特点，从80份土壤样品中筛选出13株具有糖胺聚糖降解活性的菌株，最后对其进行了16S rDNA测序鉴定，在一定程度上丰富了功能微生物资源的开发。据文献报道，产糖胺聚糖酶裂解酶的细菌主要有梭菌属、微球菌、链球菌、链霉菌等[5]。本研究筛菌结果包括了肠杆菌科、黄单胞菌科、假单胞菌科、芽胞杆菌科，来源于芽胞杆菌和黄单胞菌的糖胺聚糖降解酶有过报道。例如，薛蔚[14]报道的Bacillussp.TF18能降解大分子的透明质酸和硫酸软骨素，优化发酵条件后酶产量是15 U/mL，郭学平[21]从芽胞杆菌Bacillussp.A50纯化糖胺聚糖酶，对透明质酸的裂解活性活性高达109 U/mL。MacDonald等[20]从一株嗜麦芽窄食单胞菌中获得了一种多糖裂解酶，通过大肠埃希菌异源表达在最适反应条件下测定对透明质酸的裂解活性有42.3 U/mg。但是肠杆菌科、假单胞菌科来源的糖胺聚糖降解酶鲜有研究，部分菌属如枸橼酸杆菌属、假单胞菌属在NCBI数据库中能找到糖胺聚糖降解酶的相关基因，有潜在的蛋白序列，但是均未进行酶的功能研究。其他产酶菌可能是由于物种不完全相同或未进行过基因组相关功能的分析，因此所筛出的13个菌株可能有10株菌能产新型的糖胺聚糖降解酶。

本研究在酶活性检测中，BN3-1显示出较高的酶活性，初步鉴定为枸橼酸杆菌属菌株，NCBI数据库中具有该物种的糖胺聚糖-裂解酶相似基因，但未见相关酶研究报道。后续将对其及其他可能产新型的糖胺聚糖降解酶菌株进行克隆，再将新型的糖胺聚糖降解酶基因进行异源表达，大批发酵纯化糖胺聚糖降解酶并研究其功能和应用。