何锡然 谭晓宇 张琳 邝伟键 刘华敏 陈素平 郭家钘 梁铭炬 周伟津 霍枫
肝移植已经成为终末期肝脏疾病的主要治疗手段[1-2]。伴随肝移植手术例数的激增,供肝相对短缺的问题日益突出。因此,移植中心已经越来越多地转向于使用扩展标准供体和心死亡供体(donation after circulatory death,DCD)的器官。目前,中国42.98%的器官供体属于DCD[3]。但是传统的静态冷保存并不能有效保存DCD肝脏,而且长时间的冷保存会增加缺血再灌注损伤、移植物早期功能障碍、原发性无功和缺血性胆管病的发生风险,导致移植失败和患者死亡[4-5]。
体外常温机械灌注(normothermic machine perfusion,NMP)作为一种新的保存技术,近几年已进入临床试验阶段[6-8]。但是,该技术操作难度较大,且缺乏统一的实施标准,包括灌注温度、灌注液配方及灌注控制的模式等[9]。目前,NMP模式主要为压力控制[10]。在压力模式下,由于门静脉的压力较低,一旦压力测量出现偏差,会对流量造成较大的影响,过低的流量会导致肝脏营养供应不足,过高的流量会导致肝窦过度扩张,从而导致剪应力,破坏内皮细胞线性,进而会干扰实质细胞的保存效果,提示门静脉恒流模式可能更有利于肝脏灌注。因此,本实验对比门静脉恒压和恒流模式下对热缺血60 min肝脏常温灌注的效果,初步探索两种模式在供肝保存上的差异。
一、实验动物
健康巴马小型猪12只,雌性,体质量45~50 kg,由解放军南部战区总医院(陆总)动物实验中心提供。每头实验猪既用作血液的供体,又用作肝脏的供体。实验操作过程符合动物实验的伦理要求。
二、实验方法
(一)灌注设备 由广东顺德工业设计研究院(广东顺德创新设计研究院)、中国人民解放军南部战区总医院、广东丁沃生医疗器械有限公司联合研发的常温机械灌注设备(DEVOCEAN-LIVER 2000)可以对离体肝脏进行肝动脉和门静脉双重灌注,主要构建部件如下:2个离心泵;2个氧合器;温度传感器;2个压力传感器;2个流量传感器;2个滤血栓;温控水箱;自制的储肝器、自制的灌注管路以及自制门静脉、肝动脉、胆管插管等。
(二)猪血液及肝脏获取 在诱导麻醉后,猪耳缘静脉留置套管针建立输液通道,利用微量注射泵以每小时2~5 mg/kg的剂量泵入丙泊酚维持麻醉。气管插管,连接呼吸机。腹部正中线切口进腹,游离腹主动脉、下腔静脉及门静脉。于腹主动脉和下腔静脉置入已剪开口的16-Fr导尿管取血,血液过滤去除白细胞。静置实验猪60 min。热缺血60 min后,结扎胸主动脉,于腹主动脉和门静脉置入插管,进行在体冷灌注。快速取下肝脏,修整肝门区多余组织,剔除肝门区域的淋巴结,进行肝动脉和胆道插管,记录肝脏重量。
(三)常温机械灌注液和常温机械灌注参数设定 灌注液由猪全血1500 mL,150 mL羟乙基淀粉130/0.4电解质注射液,800 U肝素钠注射液,1 g注射用头孢西丁钠组成。灌注之前灌注管路内用150 mL羟乙基淀粉130/0.4电解质注射液混合部分全血进行预充,排除管路中的气泡。肝脏连接仪器,门静脉恒压组(n=6),门静脉压力设定为6~8 mmHg,门静脉恒流组(n=6),门静脉流量设定为0.5 mL/min/g。两组肝动脉均采用恒压脉冲式灌注,灌注压力为60/80 mmHg,灌注6 h,灌注温度为37℃。记录冷缺血时间(从在体冷灌注至肝脏上机所需的时间)。
(四)观察指标 灌注过程中每2小时取灌注液,离心后留血浆进行血气及生化检测,分析酸碱度、血糖、乳酸、尿素氮、TBil、ALT、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶等指标变化趋势。记录灌注过程中每小时产生的胆汁量。灌注过程中,每2小时取肝组织留作组织病理学检查,根据铃木评分以及其他文献介绍的办法,从淤血、空泡化、坏死、水肿以及肝窦扩张等方面进行评分,每个方面分为无、轻度、中度和重度,分别评分0、1、2、3,每张切片随机选取3个视野进行双人评分,最后统计每项得分以及总得分[11-13]。
三、统计学方法
采用SPSS 23.0统计学软件进行数据处理。正态分布的计量资料以(均数±标准误)表示,比较采用t检验,若方差不等,则采用近似t检验,若样本不服从正态分布则采用非参数检验,P<0.05为差异有统计学意义。
一、灌注前两组肝脏的对比
灌注前,门静脉恒压组的冷缺血时间为(100.50±24.32)min,门静脉恒流组的冷缺血时间为(83.50±26.51)min,(P>0.05),表明两组肝脏灌注前的缺氧情况无差异,两组可比。
二、灌注过程的血流动力学参数
两组肝动脉均采用恒压灌注模式,门静脉恒压组的平均肝动脉流量为(0.13±0.08)mL/(min·g)(肝重),而门静脉恒流组的肝动脉流量为(0.25±0.09) mL/(min·g)(肝重),其中灌注5 h和6 h两个时间点两组的肝动脉流量差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。门静脉恒压组的平均门静脉流量为(0.78±0.19)mL/(min·g),而恒流组的则为(0.54±0.07)mL/(min·g),门静脉恒压组的平均门静脉压力为(7.59±0.17)mmHg,而恒流组的则为(5.16±0.84)mmHg,由于两组门静脉控制模式不同,未对门静脉流量和压力进行比较。
图1 离体猪肝常温机械灌注过程中肝动脉流量
三、灌注过程两组血气生化指标以及胆汁生成量对比
在灌注过程中,两组的pH值均稳定维持在生理值水平附近,差异无统计学意义(P>0.05)。乳酸水平在恒流组中较低,但两组在灌注过程的比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组的血糖水平均呈先升高后下降的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。而两组的BUN在灌注过程中逐步升高,说明两组肝脏能够进行正常的蛋白质代谢,除了灌注初期的第2小时,两组灌注后期的BUN水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。在灌注过程中,两组的TBil 变化平稳,未出现明显上升,组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组在灌注结束时(6 h)肝细胞酶学差异无统计学意义(P>0.05),提示两组肝细胞受损水平相当。恒压组6 h积累胆汁生成量为(6.98±3.20) mL,恒流组6 h积累胆汁生成量为(54.47±15.63) mL,两组的每小时胆汁累积生成量差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。
图2 离体猪肝常温机械灌注过程中灌注参数和代谢指标
四、灌注过程两组病理学的改变
灌注结束时,两组的铃木评分差异无统计学意义(P>0.05),但是恒流灌注组呈较有规律的下降趋势。从淤血、空泡化、坏死、水肿以及肝窦扩张等单项评分观察,虽然恒流灌注组在灌注结束时的平均值低于恒压组,但是差异无统计学意义(P>0.05)。病理改变见图3。
图3 离体猪肝常温机械灌注过程中的病理切片(×200) a-b. 猪肝脏门静脉恒压组NMP 0 h和6 h肝组织;c-d. 猪肝脏门静脉恒流组NMP 0 h和6 h肝组织
目前国外的研究结果提示NMP比传统静态冷保存具有以下优势:①延长器官保存时间,②改善肝脏功能,③体外检测肝脏活力,④具有通过添加药物来修复受损肝脏的潜力,⑤完善肝移植的手术时间安排[4, 5, 14-16]。
本实验对NMP的门静脉灌注模式进行了初步的探索,对比了压力恒定和流量恒定两种模式对DCD肝脏常温灌注的影响。在冷缺血时间可比的前提下,两组灌注过程的血气和生化指标变化差异无统计学意义,说明相比主流的压力控制模式,流量控制模式未使肝脏出现明显的异常情况,而且各种指标变化均比较平稳,提示流量控制模式并不劣于压力控制模式的替代模式。在胆汁生成方面,流量控制模式似乎显露出其优势。在本研究中,门静脉恒流组的胆汁生成量比恒压组高,提示维持门静脉稳定的灌注可能更有利于肝细胞进行胆汁的合成。门静脉对血流的自身调节能力有限,而肝动脉则具有较强的血流自身调节能力。门静脉血流变化会引起肝动脉血流出现相应变化,即肝动脉缓冲效应,大量研究发现,小体积供肝移植术后早期,门静脉高灌注可引起肝动脉血流显著下降,从而导致胆道缺血、小叶微小血管脂肪变,最终导致移植肝细胞和胆管细胞坏死,再次减少有效肝体积[17]。控制门静脉流量更有利于维持肝动脉的流量,
从而更利于肝细胞以及胆管的供氧,进而更利于肝脏进行正常代谢。
在病理学方面,流量恒定模式的淤血、空泡化、坏死、水肿以及肝窦扩张的评分与压力恒定模式相当。Vekemans等[18]利用猪动物模型和低温机械灌注探索了流量对肝脏的影响,结果发现高流量组在灌注4 h后出现空泡,低门静脉流量联合氧气组在12 h后肝窦仍保持完整,空泡数量较少。而且低门静脉流量联合氧气组更有利于维持ATP水平。在组织病理学方面,高流量组灌注引起了更严重的肝窦扩张。说明低门静脉流量联合氧气组不仅有助于改善肝组织缺氧情况,而且能够在适当打开微循环的情况下维持肝实质的完整性。Hart等[19]利用鼠肝脏探索了低温灌注下最合适的压力,结果表明25%的压力可以达到100%的灌注,而且灌注24 h后,与50%的相比,25%的灌注压力导致的死细胞数量更少,以上结果表明较低的灌注压力不仅能够维持肝脏的有效灌注,而且能够减少内皮细胞的损伤,提示肝脏的离体灌注需要避免过量灌注。
综上所述,本实验对比了门静脉恒压灌注和恒流灌注在DCD肝脏上的灌注效果,结果表明流量控制模式并不劣于主流的压力控制模式,血气和生化指标稳定,而且流量控制模式可能更有利于肝脏的供血,从而促进肝细胞进行胆汁合成。由于目前尚无统一评价体外灌注肝脏质量的标准,因此项目组未来将开展动物肝移植实验以及临床肝移植试验,以进一步验证以上假设。