不同样本类型对EBV DNA检测结果的影响

苏 曦， 周 琰， 沈敏娜， 李懿皞， 王蓓丽， 潘柏申， 郭 玮

（复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032）

EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）是一种感染性疾病的常见病原体，与传染性单核细胞增多症、鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等密切相关[1]。目前，临床实验室检测EBV DNA的样本类型主要为血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。有研究结果显示，不同样本类型之间EBV DNA检测结果会有差异[2]。为此，本研究拟通过比较不同疾病患者不同样本类型之间EBV DNA检测结果的差异，为不同疾病患者样本的选择提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年1—12月复旦大学附属中山医院进行EBV DNA检测的患者2 694例，其中男1 639例、女1 055例，年龄12～90岁；确诊鼻咽癌84例、霍奇金淋巴瘤119例、非霍奇金淋巴瘤466例。

1.2 方法

1.2.1 样本采集及处理 采集所有对象静脉血6 mL，乙二胺四乙酸抗凝。采用梯度密度离心法提取PBMC，Ficoll分离液购自瑞典GE Healthcare公司，弃上清，留沉淀备用。将剩余血样950×g离心10 min，分离血浆，吸取100 μL血浆至Eppendorf管中，与等量DNA浓缩液充分混匀，17 950×g离心10 min，弃上清，留沉淀备用。PBMC及血浆EBV DNA提取：向含有PBMC及血浆沉淀的Eppendorf管中各加入核酸裂解液50 μL，充分混匀后100 ℃孵育10 min，15 300×g离心5 min后备用。

1.2.2 荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） EBV DNA荧光定量PCR试剂购自中山大学达安基因股份有限公司，检测仪器为LightCycler 480 PCR扩增仪（瑞士罗氏公司）。反应体系：PCR反应液40 μL、Tap酶3 μL，模版2 μL。扩增条件：93 ℃ 2 min；93 ℃ 20 s，57 ℃45 s，共40个循环；40 ℃ 10 s。每次检测均设阴性和阳性质控，分别以阳性定量参考品104、105、106、107拷贝/mL绘制标准曲线，并进行标准曲线的相关分析与回归分析。结果判定：检测到核酸扩增且增长曲线呈S型判定为检出EBV DNA（阳性），无扩增曲线判定为阴性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。将EBV DNA拷贝数进行对数转换。2种样本之间的一致性比较采用Kappa一致性检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMC和血浆EBV DNA的检测结果

2 694例样本中，PBMC EBV DNA和血浆EBV DNA均阳性的样本为131例（4.86%），血浆EBV DNA阴性而PBMC EBV DNA阳性的样本为1 045例（38.79%），血浆EBV DNA阳性而PBMC EBV DNA阴性的样本为3例（0.11%），血浆EBV DNA和PBMC EBV DNA均阴性的样本为1 515例（56.24%）。一致性检验结果显示，2种样本检测结果的一致性较低（Kappa＜0.4）。

在血浆和PBMC双阳性的131例样本中，PBMC EBV DNA拷贝数高于血浆EBV DNA拷贝数（Kappa=0.122，P＜0.001）。见图1。

图1 PBMC与血浆EBV DNA拷贝数的比较

2.2 鼻咽癌患者PBMC和血浆EBV DNA检测结果的比较

84例鼻咽癌患者中有24例（28.57%）PBMC EBV DNA阳性，血浆EBV DNA均为阴性。PBMC EBV DNA拷贝数明显高于血浆EBV DNA拷贝数（kappa=0.444，P＜0.001）。见图2。

2.3 霍奇金淋巴瘤患者PBMC和血浆EBV DNA检测结果的比较

1 1 9例霍奇金淋巴瘤患者中有4 5例（37.82%）PBMC EBV DNA阳性，有6例（5.04%）PBMC和血浆EBV DNA均阳性，有39例（32.77%）血浆EBV DNA阴性而PBMC EBV DNA阳性，有74例（62.18%）PBMC和血浆EBV DNA均阴性。PBMC EBV DNA拷贝数高于血浆EBV DNA拷贝数（Kappa=0.161，P＜0.001）。见图3。

图2 鼻咽癌患者PBMC与血浆EBV DNA拷贝数的比较

图3 霍奇金淋巴瘤患者PBMC与血浆EBV DNA拷贝数的比较

2.4 非霍奇金淋巴瘤患者PBMC和血浆EBV DNA检测结果的比较

4 6 6例非霍奇金淋巴瘤患者有1 9 3例（41.42%）PBMC EBV DNA阳性，有24例（5.15%）PBMC和血浆EBV DNA均阳性，有169例（36.27%）血浆EBV DNA阴性而PBMC EBV DNA阳性，有273例（58.58%）PBMC和血浆EBV DNA均阴性。PBMC EBV DNA拷贝数明显高于血浆EBV DNA拷贝数（Kappa=0.143，P＜0.001）。见图4。

图4 非霍奇金淋巴瘤患者PBMC与血浆EBV DNA拷贝数的比较

3 讨论

目前，检测EBV的方法主要为病毒的分离和鉴定、病毒抗原检测、血清学检测以及分子生物学方法等。随着检测技术的进步，分子诊断成为EBV检测的主要方法。与其他检测技术相比，PCR具有敏感性高、特异性好等优点，有助于疾病的早期发现、早期治疗及疗效监测。检测EBV DNA的样本主要为PBMC和血浆，但提取PBMC步骤繁琐，手工操作较多，易影响检测结果。

本研究结果显示，PBMC EBV DNA和血浆EBV DNA检测结果的一致性差（Kappa＜0.4）。外周血中的EBV DNA一般是以溶解的线型DNA或环状DNA形式游离存在，血浆中的EBV载量远低于PBMC。因此，不建议以血浆完全替代PBMC进行EBV DNA检测。

EBV DNA阳性是EBV存在的直接证据。EBV在感染细胞内主要有2种存在形式：增殖性感染和潜伏性感染[3]。由于存在潜伏感染，因此在正常人PBMC中也可能有低拷贝的EBV DNA被检出，但通常低于实验室阳性报告范围。EBV感染人体后便进入增殖期，病毒在淋巴细胞中大量增殖并释放入血浆或淋巴液中，此时在患者PBMC或血浆中可检测到高拷贝的EBV DNA。因此PBMC中的EBV DNA拷贝数一般远高于血浆。在病毒潜伏阶段，对PBMC中的EBV DNA进行检测，可对疾病进行早期诊断或进行疗效监测。而在病毒增殖阶段，EBV在PBMC中大量增殖，导致细胞破裂、溶解，病毒大量释放入血，此时检测血浆中的EBV DNA价值更大。

另外，本研究还回顾分析了患者的病史资料，比较了鼻咽癌患者、霍奇金淋巴瘤患者和非霍奇金淋巴瘤患者PBMC和血浆样本中EBV DNA的阳性率。结果显示，不同疾病患者PBMC与血浆样本中EBV DNA的阳性率和拷贝数均有差异。

有学者认为鼻咽癌患者首推的样本类型是血浆[4]。还有学者认为鼻咽癌患者血浆和PBMC的EBV DNA检测结果有很好的一致性[5]。本研究结果显示，在24例EBV DNA阳性的鼻咽癌患者中，PBMC EBV DNA阳性率及拷贝数均高于血浆（P＜0.001）。原因可能与本研究的鼻咽癌患者绝大部分处于放疗治疗中或治疗后有关。FAN等[6]发现，在鼻咽癌缓解期患者的血浆中很难检测到EBV DNA，鼻咽癌患者血浆中的EBV DNA拷贝数可能与疾病进程及治疗程度有关。本研究未按疾病进程对鼻咽癌患者再进行分组统计，这可能是血浆EBV DNA阳性率及拷贝数低于PBMC的原因。

本研究结果显示，在霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤中，PBMC EBV DNA阳性率及拷贝数均高于血浆（P＜0.001），这与朱耀武等[7]的研究结果一致，但阳性率低于陆海英等[8]的报道。由此可见，对于EBV感染患者，检测PBMC EBV DNA的敏感性高于血浆，可用于临床治疗后的动态监测。本研究EBV DNA阳性率低于文献报道[8]，可能与本研究入组的淋巴瘤患者，未按疾病治疗进程进行分组有关。对于需进行动态监测的患者，可以通过设定临界值来判断病毒感染处于潜伏期还是活动期。

综上所述，由于PBMC EBV DNA阳性率和拷贝数均高于血浆，且EBV DNA拷贝数与患者是否需接受治疗密切相关。因此，对于EBV感染的诊断和监测，实验室工作人员应与临床沟通，结合疾病类型选用合适的样本类型。