高温大曲中产四甲基吡嗪细菌的筛选及鉴定

钟桂芳，张 帆，郭辉祥，周忆菲，马歌丽，王光路*

（1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院 食品生产与安全河南省协同创新中心，河南 郑州450001；2.舍得酒业股份有限公司，四川 射洪629209）

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，属生物碱类，是一种含氮杂环化合物，广泛存在于食品原料、咖啡以及乳制品中，具有烘烤香气、甜香，是中国白酒中的重要香气化合物之一[1]。除了作为食品风味添加剂提升香气外，四甲基吡嗪还是中药川芎的重要活性成分，可用于对疾病的预防[2]。近年来，我国许多白酒企业为提高白酒中四甲基吡嗪含量，开展了如何利用微生物发酵酒曲以及优化条件的研究[3-6]，并已成为研究白酒对人体健康作用的重要部分[7]。

徐岩等[8]研究验证了中国白酒发酵过程中TTMP的产生主要来源于微生物的代谢反应，而非美拉德反应。比如芽孢杆菌可利用底物合成四甲基吡嗪的前体3-羟基丁酮（又称乙偶姻），3-羟基丁酮进一步与氨反应生成四甲基吡嗪。陈梦圆等[9]通过固态发酵法从高温大曲中筛选得到2株高产四甲基吡嗪菌株，分别为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis），发酵10 d后产量最高可达（150.92±0.783）mg/L。王晓丹等[10]对产四甲基吡嗪地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）进行了研究，结果表明，将筛选得到菌株按最佳添加量5%添加到窖池中层的糟醅中，发酵后的酒醅四甲基吡嗪含量达6.81 μg/g，是对照组的3.03倍。ZHU B F等[11]对从高温大曲分离得到的利用乙偶姻产四甲基吡嗪的厌氧芽孢杆菌（Bacillussp.）进行了研究，经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。并对该菌产四甲基吡嗪的发酵条件进行了优化，得到的TTMP产量＞4.08 g/L，为目前最高的报道，同时研究发现高浓度的磷酸氢二铵有利于四甲基吡嗪的产生。

我国酱香型、芝麻香型、浓香型白酒中四甲基吡嗪含量比较高[12-14]，目前大多集中在对酱香型和浓香型白酒中TTMP的研究。本研究通过从高温酒曲中分离纯化菌株，采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪筛选出高产TTMP的菌株，通过观察其菌落形态和细胞形态，结合利用16S rRNA鉴定，对高产TTMP的菌株进行菌种鉴定及挥发性成分分析。旨在增加白酒的风味及保健功能，为高产菌株在浓香型白酒中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

高温大曲：舍得酒业股份有限公司。

1.1.2 化学试剂

四甲基吡嗪标品（纯度98%）：上海源叶生物科技有限公司；二氯甲烷（色谱级）：天津市大茂化学试剂厂；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌30 min。

液体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min。

富集培养基：酵母膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，淀粉3 g/L，MgSO4·7H2O 0.01 g/L，KH2PO40.2 g/L，Na2HPO42 g/L，pH 7.8，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨30g/L，磷酸氢二铵30 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min，葡萄糖单独灭菌，115 ℃灭菌20 min。

V-P培养基：6%α-奈酚酒精溶液为甲液，40%氢氧化钾为乙液。

1.2 仪器与设备

GR85DA型蒸汽灭菌锅：济南来宝医疗器械有限公司；SHP-25型恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；Mixer 4k型微型漩涡混合仪：生工生物工程（上海）股份有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；PX2型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：上海赛默生物科技有限公司；DYCP-31脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）电泳槽、DYY5稳压电泳仪：北京六一仪器厂；FR980凝胶成像仪：上海复日科技仪器有限公司；7890A自动进样气相色谱质谱联用仪：安捷伦科技（中国）有限公司；ZQWY-200S型三层组合式全温振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；BSA2202S型电子天平：北京赛多利斯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 产四甲基吡嗪菌株的分离纯化

在无菌环境下，称取10.00 g酒曲样品加入到100 mL无菌水，37 ℃、200 r/min振荡30 min。85 ℃水浴加热30 min，取上清液5.00 mL加入95 mL的富集培养基中，37 ℃、200 r/min振荡富集处理24 h。将培养好的富集液进行稀释，配成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度的菌悬液。吸取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度菌悬液各50 μL进行涂布培养，37 ℃倒置培养24 h。挑取平板上不同形态的菌株，将获得的单菌落进行平板划线处理，多次纯化。将纯化好的单菌落进行细菌染色处理，观察菌落形态以及细菌的形态，去掉重复的细菌，-80 ℃保存菌种。

1.3.2 菌株液态发酵实验

由文献[15]可知，四甲基吡嗪发酵体系的前体物质为乙偶姻，在碱性条件下，乙偶姻被氧化为2,3-丁二酮，2,3-丁二酮与肌酸产生粉红色的复合物。借助V-P实验[15]进行乙偶姻含量高低初步检测，实现对产四甲基吡嗪菌株的初筛。

将纯化的菌种分别接入含5 mL的液体培养基的试管内，37 ℃、200 r/min培养15～18 h。4%接种量于发酵培养基内，37 ℃、200 r/min培养36 h。取1 mL加入V-P培养基的试管内振荡混匀，放置5 min，观察颜色变化。如果颜色不深可再培养一段时间。选取阳性反应的菌株进行高产四甲基吡嗪菌株的复筛。

将经过初筛的菌株继续培养，47 ℃、200 r/min培养24 h，随后升至60 ℃，200 r/min培养12 h[16]。然后取10 mL发酵液，用10 mL的二氯甲烷萃取。步骤为：将蒸馏液加入10 mL的二氯甲烷，超声20 min混合均匀，倒入分液漏斗中，排出气体，静置30 min，可明显看到分层，将下层液体从下方流出，上层液体从上方倒出，再将下方倒出的液体加入10 mL的二氯甲烷进行萃取，重复上述步骤3次，则得到30 mL萃取液，浓缩至1 mL，用气相色谱-质谱联用仪测定其TTMP的含量。

1.3.3 高产四甲基吡嗪菌株的鉴定

菌株形态鉴定：将筛选出TTMP产量高的菌株在平板上活化，再以点接法接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，37 ℃条件下培养48 h后观察其在培养基上颜色、大小、质地、边缘整齐性、表面光滑性等菌落形态特征。将保存菌株接种到液体培养基中，在37 ℃、200 r/min条件下培养24 h。将活化后的菌株制片，染色后显微镜观察其菌体形态。

菌株分子生物学鉴定：根据细菌DNA提取试剂盒说明书，采用细菌16S rDNA通用27F（5'-AGAGTTTGATCCGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增，在25.0 μL聚合酶链式反应（PCR）体系中，上、下游引物1492R和27F各1.0 μL，TaqMaster Mix 12.5 μL，细菌DNA 0.5 μL，双蒸水（ddH2O）10.0 μL。PCR扩增条件为初始变性94 ℃、15 min；然后变性94 ℃、0.5 min，退火55 ℃、0.5min，复性72℃、1.5 min，30个循环，最后延伸72 ℃、10 min，反应结束后4 ℃保存。取5 μl细菌DNA溶液加1 μL Loading buffer于1%琼脂糖凝胶120 V电泳25～30 min。

测序由上海生物工程有限公司完成，采用16S rRNA鉴定方法对菌株进行分子生物学鉴定。所得测序结果输入美国国家生物信息技术中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对，用邻接（neighbor-joining，NJ）法构建目标菌株的系统发育树。

1.3.4 四甲基吡嗪含量的测定[17-19]

四甲基吡嗪含量测定采用气相色谱-质谱联用（GCMS）法。

四甲基吡嗪标准曲线的绘制：准确称取0.05 g（精确到0.000 1 g）的四甲基吡嗪，溶于100 mL的色谱级二氯甲烷，定容至刻度线，配制成500 mg/L的四甲基吡嗪标样母液。移液管依次移取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、8 mL 500 mg/L的四甲基吡嗪标样溶液于10 mL容量瓶中，定容至刻度线，即配制成50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、400 mg/L四甲基吡嗪系列标准溶液。四甲基吡嗪系列标准溶液在选定的色谱条件下测定，以四甲基吡嗪质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，绘制TTMP标准曲线。

气相色谱条件：弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×1 μm），柱温40 ℃（保持1 min），以10 ℃/min升温至150 ℃，再以10 ℃/min升温至210 ℃保持10 min，再以20 ℃/min升温至230 ℃保持4 min，运行时间52 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯氦气（He）（纯度99.999%）；柱前压7.334 psi，载气流速1 mL/min；分流进样，分流比为20∶1。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，四级杆温度150 ℃，溶剂延迟时间8 min，全扫描。

定性定量方法：采用选择离子扫描模式对四甲基吡嗪的4个特征离子进行扫描。GC-MS联用仪得出其峰面积，根据峰面积与含量成正比的关系，通过已建立的浓度-四甲基吡嗪峰面积标准曲线回归方程，计算筛选菌株产四甲基吡嗪含量。

2 结果与分析

2.1 四甲基吡嗪标准曲线的绘制

应用GC-MS法测定四甲基吡嗪，以四甲基吡嗪质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，绘制四甲基吡嗪标准曲线见图1。由图1可知，四甲基吡嗪保留时间为14.467min，标准曲线线性方程为y=6E+07x，相关系数为R2=0.9899，表明二者线性关系良好。

图1 四甲基吡嗪标准曲线Fig. 1 Standard curve of tetramethylpyrazine

2.2 高产四甲基吡嗪菌株的筛选

采用平板稀释涂布法，从大曲样品中分离到具有不同特性菌株，接种到牛肉膏蛋白胨培养基中进行活化。通过V-P培养基筛选，将3-羟基丁酮含量作为重要筛选指标，筛选出10株呈阳性反应且颜色较深菌株。将筛选的10株分别接种于发酵培养基中进行发酵培养，经过72 h发酵，检测各菌株的TTMP产生能力，结果见图2。由图2可知，菌株A7、A18四甲基吡嗪产量较高，分别为350.98 mg/L、163.49 mg/L，将两株高产菌株用于进一步的分析。

图2 不同菌株产四甲基吡嗪含量的测定结果Fig. 2 Determination results of tetramethylpyrazine contents produced by different strains

2.3 高产四甲基吡嗪菌株的鉴定

2.3.1 菌株的形态学观察

对筛选出的菌株A7、A18接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，观察其菌落形态特征，结果见图3。由图3可知，菌株A7菌落呈白色圆形，呈凝胶状，边缘整齐，表面呈突起的圆形，有黏性，湿润。经染色后，细胞形态为短杆状；菌株A18菌落为白色圆形，边缘整齐，中间厚边缘薄，表面粗糙干燥，附着力强。经染色后，细胞形态同为短杆状。

图3 菌株A7、A18的菌落形态（A、B）及细胞形态（C、D）Fig. 3 Colony (A, B) and cell (C, D) morphology of strains A7 and A18

2.3.2 菌株的分子生物学鉴定

采用通用引物27F和1492R，利用PCR扩增获得高产菌株A7和A18的16S rDNA序列，并交由上海生工有限公司进行序列测定。将测得核苷酸序列通过NCBI-BLAST程序在GenBank数据库中进行比对，选取相关菌种的同源性高的序列。采用MEGA-X软件进行序列比对，NJ法多序列连配分析后构建系统发育树，结果见图4。由图4A可知，菌株A7与多株芽孢杆菌同源性为99%，与模式菌株甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）RY1处于同一分支，结合菌落形态分析，可鉴定菌株A7为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。由图4B可知，菌株A18与多株芽孢杆菌同源性为99%，与模式菌株蛋白水解芽孢杆菌（Bacillus proteolyticus）CBD 119处于同一分支，结合菌落形态分析，可鉴定菌株A18为蛋白水解芽孢杆菌（Bacillus proteolyticus）。

图4 基于16S rDNA序列分析菌株A7（A）及菌株A18（B）的系统发育树Fig. 4 Phylogenetic tree of strains A7 (A) and A18 (B) based on 16S rDNA gene sequences analysis

2.4 菌株A7代谢产物的GC-MS分析

对菌株A7进行了模拟液态发酵实验，发酵72 h后，到达TTMP的最大积累量，同时对发酵成分进行分析。发酵液取10 mL，以5 000 r/min离心10 min以除去菌体，取上清液与二氯甲烷等体积混合后进行蒸馏，收集馏分，对馏分进行GC-MS分析，对其发酵产物的挥发性香味成分进行了测定，其GC-MS检测总离子流色谱图见图5，各成分含量检测结果见表1。

图5 菌株A7发酵产物挥发性成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig. 5 Total ion chromatogram of volatile components in fermentation products of strain A7 analysis by GC-MS

表1 菌株A7发酵产物挥发性成分GC-MS分析结果Table 1 Results of volatile components contents in fermentation products of strain A7 analysis by GC-MS

续表

由图5和表1可知，在菌株A7发酵产物中，吡嗪类化合物相对含量最高，达到了47.05%，其中以四甲基吡嗪为主，相对含量为45.30%。其次是酮类化合物，相对含量为21.76%，其中以3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）为主，相对含量为21.54%。醇类化合物相对含量为13.81%，以2,3-丁二醇为主，相对含量为13.79%。酸类物质相对含量为4.08%，醛类物质相对含量为0.46%，酯类物质相对含量为6.85%，还有一些其他的烷烃类和杂环类和未测定出的化合物，总相对含量为4.30%。

3 结论

通过稀释涂布法，从大曲中分离得到的细菌中有10株菌株具有产四甲基吡嗪的能力。通过模拟液态发酵工艺，梯度升温发酵，获得2株液态发酵高产四甲基吡嗪菌株A7和A18，其四甲基吡嗪的含量分别为350.98 mg/L、163.49 mg/L。结合菌株形态学观察和分子生物学方法，菌株A7被鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus），菌株A18被鉴定为蛋白水解芽孢杆菌（Bacillus proteolyticus）。菌株A7液态发酵产物中的挥发性成分GC-MS检测结果表明，其液态发酵产物中吡嗪类物质含量较高（40.05%）。结合液态发酵产物感官评价，其发酵产物香气浓郁，这与白酒中风味的特征性成分以吡嗪类等物质为主的说法相符。液态发酵过程相对于固态发酵来说时间短、效率高，适用于实验室进行小规模筛选高产四甲基吡嗪的菌株。在不同香型白酒中，四甲基吡嗪的含量有所差异，据此可对白酒生产工艺进行改进，提高该组分在白酒中的含量，改善白酒品质[20]。