微切助柑橘皮粉提取物的抗氧化活性研究

刘亚美,陈琼,吴菲菲,李化强

(邵阳学院 食品与化学工程学院,湖南 邵阳,422000)

柑橘皮(citruspeel)是一种宝贵的生物资源,目前研究人员对柑橘皮含有的化学成分进行了研究。柑橘皮中有许多对人体健康有好处的成分[1],并且含有大量的活性成分,比如黄酮类化合物、色素、类柠檬苦素、香精油等[2-3]。自21世纪以来,柑橘的栽培面积以及生产规模快速扩展,使得柑橘加工过程中果皮量急剧增加,因得不到有效利用给生产商造成了巨大的经济亏损[4-5],所以，寻求柑橘皮渣的综合利用存在着一定的经济效益,其化学成分的重新开发在药理、食品加工行业、抑菌抗菌和农业等方面都具有极高的应用价值[6-8]。本实验利用微切助互作技术处理原料,已成为近年来辅助物料粉碎的一种极佳方式和创新点[9-10]。微切助互作技术是将本实验所需要的原料和研磨助剂氯化钙按照一定的比例混合在一起,再利用高强度研磨,使它们产生机械化学效应,从而提取出需要的有效成分。微切助互作技术的原理是在研磨过程中,通过研磨助剂让粗粉更加容易发生相互作用从而改变柑橘皮有效成分的微观性能,进而改变其溶解性,本技术被应用于辣椒和鹿角盘等物料的前处理[11-12]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试柑橘皮采集于邵阳学院果蔬清洁加工实验室,将其干燥、粉碎、微切助互作技术研磨后备用。

试剂:DPPH(合肥博美生物科技有限责任公司)，硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid,TBA)(合肥巴斯夫生物科技公司)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)(上海如吉生物科技公司)，邻苯三酚(上海伊卡生物技术公司)等试剂为优级纯；三氯乙酸，VC，无水乙醇，FeSO4，水杨酸等试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1780紫外分光光度计(岛津公司)；H2-16K高速冷冻离心机(重庆市松朗电子仪器有限公司)；RE-5299旋转蒸发器(巩义市予华仪器有限责任公司)；万能高速粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)；SZM-20超微粉碎机(安徽皖南电机有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；DLSB-10低温冷却循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；HC-51R远红外快速干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)等。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

柑橘皮晾干水分,放入鼓风干燥箱中60 ℃干燥后用万能高速粉碎机粉碎过140目筛(0.106 mm),重复多次,得到橘皮粗粉,将1.5 kg柑橘皮粗粉混合3%大颗粒氯化钙助剂装入超微粉碎机,粉碎40 min,密封备用。

1.3.2 样品的制备

水提物制备:称取10 g柑橘皮微切助粉放入500 mL锥形瓶中,料液比为1∶15,加入150 mL蒸馏水进行提取,充分摇匀,将锥形瓶搁置黑暗处浸提12 h。取出放入50 ℃恒温水浴0.5 h,4 800 r/min离心5 min,取上清液,余下的样品重复上述操作2次。收集全部上清液,50 ℃旋转蒸发3～4 h后放入50 ℃干燥箱中恒重5 h。称取1 g冷却后的样品置于100 mL容量瓶,用蒸馏水定容至刻度,制得初始质量浓度为10 g/L的柑橘皮水提物溶液,用10 g/L的柑橘皮水提物溶液稀释适宜倍数制得5.0，2.0，1.5，1.0，0.5，0.3，0.2和0.1 g/L的水提物溶液。

醇提物制备:称取10 g柑橘皮微切助粉放入500 mL锥形瓶中,料液比1∶15,加入150 mL 70%无水乙醇进行提取,步骤同上，制备醇提物,制得初始质量浓度为10 g/L的柑橘皮醇提物溶液,用10 g/L的柑橘皮醇提物溶液稀释适宜倍数制得质量浓度为5.0，2.0，1.5，1.0，0.5，0.3，0.2和0.1 g/L的醇提物溶液。

注：本实验橘皮提取物的标准溶液的1 g橘皮粉用溶液稀释而成，采用质量浓度进行表达。

1.3.3 抗氧化测定

1)DPPH自由基清除能力的测定。参照霍艳荣等[13-15]的试验方法:

清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

式中：Ai为DPPH溶液与柑橘皮提取物或VC的平均吸光度；Aj为柑橘皮提取物或VC与溶剂的平均吸光度；A0为DPPH溶液与溶剂的平均吸光度。

2)羟基自由基清除能力的测定。参照刁小琴等[16-18]的试验方法:

清除率=(A-Ai)/A×100%

式中：A为空白组的平均吸光度；Ai为柑橘皮提取物或VC的平均吸光度。

3)超氧阴离子自由基清除能力的测定。参照刁小琴等[16-18]的试验方法:

清除率=(A-Ai)/A×100%

式中：A为空白组的平均吸光度；Ai为柑橘皮提取物或VC的平均吸光度。

4)抗脂质过氧化清除能力的测定。参照韩娅婷等[19-20]的试验方法:

抑制率=(A-Ai)/A×100%

式中：A为空白组的吸光度；Ai为柑橘皮提取物或VC的平均吸光度。

1.4 数据处理

选取Excel计算样品的平均值并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除能力分析

由图1可知:在0.2～5.0 g/L范围内,柑橘皮水提物和VC对DPPH都具有较强的清除能力,在质量浓度为0.2 g/L时VC就达到96.40%左右的高清除率,水提物的清除率远远低于VC的清除率,而当质量浓度达到2.0 g/L时,两者的清除率几乎接近。而柑橘皮醇提物的清除率整体趋势平缓,在质量浓度低于2.0 g/L的时候,醇提物的清除率随着质量浓度的升高而增加,当质量浓度大于2.0 g/L时，清除率趋于平稳状态。从整体趋势上看,VC和柑橘皮水提物对DPPH的清除能力要强。

图1 不同溶剂提取物和 VC 对 DPPH 自由基清除作用的对照

2.2 羟基自由基清除能力分析

由图2可知:在质量浓度低于1.0 g/L时,柑橘皮提取物和VC的清除率上升趋势比较明显；当质量浓度高于2.0 g/L时，三者的清除率变化平缓。从整体趋势上看,柑橘皮醇提物比柑橘皮水提物的清除能力要更强。

图2 不同溶剂提取物和VC对羟基自由基清除作用的对照

2.3 超氧阴离子自由基清除能力分析

由图3可知:在质量浓度为0.2～5.0 g/L范围内,柑橘皮提取物随着质量浓度的变化上升趋势比较明显,在质量浓度为0.2 g/L时,VC的超氧自由基清除率就已经达到了72.41%,而柑橘皮提取物的清除率只有30%左右,当质量浓度达2.0 g/L时，柑橘皮醇提物和VC的清除率逐渐平缓。在清除超氧阴离子方面,柑橘皮醇提物和柑橘皮水提物相差很小。

图3 不同溶剂提取物和VC对超氧阴离子自由基清除作用的对照

2.4 抗脂质过氧化能力分析

由图4可知:不同质量浓度柑橘皮提取物和VC的抗脂质过氧化的能力都不是很理想,在最低质量浓度时,柑橘皮醇提物和VC的抗脂质过氧化能力相近,柑橘皮水提物偏高；在高质量浓度时,三者的抑制能力趋于平缓。原因是柑橘皮提取物对卵黄脂蛋白的脂质过氧化具有一定的抑制作用,因为卵黄磷脂的第二位碳上含有的多不饱和脂肪酸容易在二价铁离子的催化下发生脂质过氧化,而柑橘皮皮提取物中的酚类物质能够释放氢离子,破坏产生的过氧化物,将其分解为其他物质而抑制脂质的过氧化。

图4 不同溶剂提取物和VC对抗脂质过氧化能力的对照

3 结论与讨论

柑橘皮提取物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基和抗脂质过氧化都具备了一定的清除能力。DPPH自由基清除能力的测定是评价天然产物抗氧化活性的重要方法,本实验柑橘皮水提物的DPPH自由基清除能力强于柑橘皮醇提物,在质量浓度为2.0 g/L时,柑橘皮水提物的清除率与VC的清除率几乎一致,其原因是柑橘皮本身的颜色对测定结果造成较大的影响[21],醇溶剂提取柑橘皮色素的能力显著强于水溶剂,而柑橘皮醇提物的颜色过深,最终造成测定结果的偏差。对清除超氧阴离子自由基和羟基自由基而言,柑橘皮水提物和柑橘皮醇提物的清除能力差距很小,VC的清除能力显著,造成此现象的原因是前者测定时间控制不当,导致产生的超氧阴离子进一步氧化,后者实验体系对柑橘皮自身的pH要求很高,从而使得两者整体的清除效果不佳。在抗脂质过氧化这方面的能力柑橘皮提取物相对较弱,原因是柑橘皮提取物对卵黄脂蛋白的脂质过氧化具有一定的抑制作用,因为卵黄磷脂的第二位碳上含有的多种不饱和脂肪酸容易在二价铁离子的催化下发生脂质过氧化[21],而柑橘皮提取物中的酚类物质能够释放氢离子,破坏所产生的过氧化物,将其分解为其他物质而抑制脂质的过氧化,故比较不同实验结果时也要考虑实验对象。综合上述测定分析,当柑橘皮提取物质量浓度达到2.0 g/L左右时,清除率的变化趋势逐渐平缓,这可能是柑橘皮粗提物中的某些成分对抗氧化性能进行了干扰,如果将柑橘皮提取物纯化再进行抗氧化活性研究,其抗氧化能力会更强。本实验采用微切助互作技术提取天然产物的抗氧化成分显著优于传统方式,不仅成本低,还具有高效和环保的属性[22-24],微切助互作技术粉碎柑橘皮,极大程度地使柑橘皮中活性成分浸提出来,极大地促进了有效物质的释放。随着公众对合成抗氧化剂潜在危害的认知,从天然产物中提取安全、高效的抗氧化物质成为了研究者们研究的热点。本课题结合当地资源反复筛选,使用富含多种抗氧化成分的柑橘皮为研究对象,更好地实现可持续发展这一理念,从应用价值来看柑橘皮水提物优于醇提物,可以在功能食品、医药或化妆品等方面得到应用。