汉防己乙素抑制P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化缓解心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡和线粒体氧化损伤

李 昌，王爱玲，肖跃红，张占海，张 琮，曾宪峰

（1.南阳医学高等专科学校中医系，河南 南阳 473000；2.南阳市中心医院重症医学科，河南 南阳473000；3.南阳医学高等专科学校第一附属医院心内科，河南 南阳 473000）

由心血管事件和急性心肌缺血低氧性心肌病引起的心血管疾病在世界范围内是一个严重的健康问题，发病率和死亡率均在不断上升［1］。近年来，心血管疾病的临床治疗主要包括及时复活、溶栓、经皮冠状动脉介入治疗，以恢复供血平衡，从而治疗心血管疾病［2］。但再灌注也会导致一系列不良事件，如线粒体代谢异常、内质网应激、炎症细胞因子释放、心肌细胞凋亡，从而加重损伤程度［3］。心力衰竭患者5年生存率远低于恶性肿瘤，且发病率逐年升高，因此，急需开发减轻心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤的新药。汉防己乙素（fangchinoline，Fan）是一种从防己科千金藤属植物粉防己块根分离的生物碱，具有抗氧化、抗炎和抗癌活性［4-6］。且已有研究表明，Fan能抑制肝I/R损伤时氧自由基的生成，增强对其的清除，从而保肝［7］。Fan对心肌I/R损伤的作用虽然尚不清楚，但已有报道，粉防己碱（tetrandrine）能明显抑制I/R损伤引起的心肌细胞凋亡，其作用机制可能与促进Bcl-2蛋白表达、减少Bax蛋白表达、升高Bcl-2/Bax比值有关［8］，因此，预测与粉防己碱同为双苄基异喹啉衍生物的Fan对心肌I/R时心肌细胞凋亡和线粒体损伤也具有抑制作用。本研究主要探讨Fan对心肌I/R大鼠心肌细胞凋亡和线粒体损伤的影响，以期为Fan应用于临床治疗心肌缺血引起的心血管疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器

Fan（纯度HPLC≥99%，上海融禾医药科技发展有限公司，中国）用10%DMSO和90%生理盐水溶液配制成1，3，10 mg·mL-1溶液，盐酸维拉帕米（verapamil hydrochloride，VH，纯度HPLC≥98%，江苏四环生物制药有限公司）用生理盐水配制成20 mg·mL-1溶液）；二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒（PIERCE公司，美国）；MatrigelTM底膜基质（BD公司，美国）；兔抗大鼠胱天蛋白酶3、Bcl-2、Bax、c-Myc、P38丝裂原活化蛋白激酶（P38 mitogenactivated protein kinase，P38 MAPK）、细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulatory protein kinase，ERK1/2）单克隆抗体（Sigma公司，美国）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）；大鼠肌红蛋白（myohemoglobin，Mb）和肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase MB，CK-Mb）ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Varioskan Flash多功能酶标仪（Thermo Fisher公司，美国）；OLYMPUS DP71显微镜（奥林巴斯光学有限公司，日本）；高速低温离心机（Beckman公司，美国）；电泳槽和电转仪（Bio-Rad公司，美国）；凝胶成像系统GDS-800 UVP（UVP公司，美国）。

1.2 动物、心肌l/R损伤模型制备和分组

54只SPF级健康成年雄性SD大鼠（河南省实验动物中心），许可证号：SCXK（豫）2017-0001。鼠龄为6～8个月，体质量200～240 g。随机分为6组，分别为假手术组、模型组（I/R）、I/R+Fan 1，3和 10 mg·kg-1组，I/R+VH 20 mg·kg-1组，每组9只。除假手术组外，其余组大鼠结扎左前降支冠状动脉缺血30 min后，松开结扎线再灌注90 min。假手术组仅穿线不结扎，其余操作相同。I/R+Fan 1，3和10 mg·kg-1组和I/R+VH 20 mg·kg-1组在造模前 20 min ip 给予 Fan 1，3，10 mg·kg-1或 VH 20 mg·kg-1［9］，假手术组和I/R 组大鼠ip给予等量10%DMSO和90%生理盐水溶液。检测各组大鼠心功能指标后，处死大鼠，收集外周血，分离心肌组织，用于后续检测。

1.3 心功能指标平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）和左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）的检测

取1.2分组大鼠，左侧股动脉插管，连接三通和U型水银血压计，用于记录MAP；右侧颈总动脉插管至左室，连接BioLab-410型生物信号采集和处理系统测定LVSP。

1.4 ELlSA检测血清中Mb和CK-MB的含量

按大鼠Mb和CK-MB ELISA试剂盒说明书测定大鼠血清Mb和CK-MB的含量。

1.5 HE染色观察心肌组织病理损伤

每组大鼠取左室相同部位心肌组织放入4%多聚甲醛溶液进行固定，24 h后脱水，石蜡包埋、切片；然后HE染色：将切片分置二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ、梯度乙醇各10 min，自来水冲洗；苏木精染色、伊红染色；由低到高浓度乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；光学显微镜拍照，观察其形态特征。

1.6 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡

将石蜡切片进行脱蜡、复水及抗原修复，然后使用TUNEL反应试剂盒，将配好的反应液滴于标本上，置湿盒中，37℃ 1 h。用PBS洗3次，每次15 min，滴加合适浓度的ToPro15 min，然后再用PBS洗3次，每次15 min。最后用中性树脂封片，在OLYMPUS DP71显微镜下拍照。

1.7 试剂盒检测心肌细胞SOD活性及MDA和GSH含量

每组大鼠于左心室相同部位取100 mg心肌组织匀浆，分别采用SOD，MDA和GSH试剂盒测定SOD活性及MDA和GSH含量。

1.8 Western印迹法检测心肌组织胱活化天蛋白酶3、Bcl-2、Bax、c-Myc蛋白表达水平和P38 MAPK和ERK1/2磷酸化水平

每组大鼠于左心室相同部位取250 mg心肌组织匀浆，加含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，1∶3加入，匀浆，15 000×g，离心 10 min，取上清，据BCA试剂盒说明书测蛋白浓度。匀浆上清液与上样缓冲液1∶1配比，电泳，转膜，封闭，兔抗大鼠单克隆一抗（胱天蛋白酶3 1∶1000，Bcl-2 1∶500，Bax 1∶1000，c-Myc 1∶500，p-P38 MAPK 1∶1000，P38 MAPK 1∶1000，p-ERK1/2 1∶1000，ERK1/2 1∶1000）4℃过夜，山羊抗兔二抗（1∶2000）室温孵育1 h，TBST漂洗，ECL发光剂显影，采用 Bio-Rad Gel Doc XR+凝胶成像系统采集图像，以目标蛋白与内参蛋白积分吸光度比值表示蛋白表达水平，以磷酸化蛋白与总蛋白比值表示蛋白磷酸化水平。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 Fan对心肌l/R大鼠心功能MAP和LVSP的影响

与假手术组比较，I/R组LVSP和MAP水平显著降低（P＜0.05）；与I/R组比较，I/R+Fan 3和10 mg·kg-1及I/R+VH 20 mg·kg-1组LVSP和MAP水平均显著升高（P＜0.05）（表1）。

Tab.1 Effect of fangchinoline（Fan）on mean arterial pressure（MAP） and left ventricular systolic pressure（LVSP）of ischemia/reperfusion（l/R）rats

2.2 Fan对心肌l/R大鼠血清中Mb和CK-MB含量的影响

与假手术组比较，I/R组Mb和CK-MB含量显著升高（P＜0.05）；与I/R组比较，Fan 3，10 mg·kg-1和I/R+VH20mg·kg-1组Mb和CK-MB含量均显著降低（P＜0.05）（表2）。

Tab.2 Effect of Fan on serum myohemoglobin（Mb）and creatine kinase MB（CK-MB）in l/R rats

2.3 Fan对心肌l/R大鼠心肌病理损伤的影响

假手术组心肌细胞边缘清晰，核膜完整，心肌纤维排列整齐，无细胞间物质水肿；I/R组和I/R+Fan 1 mg·kg-1心肌细胞出现肿胀，明显的细胞间质水肿，界限模糊，有少量交叉条纹；I/R+Fan 3，10 mg·kg-1和I/R+VH20 mg·kg-1组心肌细胞心肌排列紊乱和心肌损伤明显减轻（图1）。

Fig.1 Effect of Fan on myocardial pathological changes in l/R rats（HE staining）.See Tab.1 for rat treatment.Arrows show the locations of serious myocardial injury.

2.4 Fan对心肌l/R大鼠心肌细胞凋亡的影响

与假手术组比较，I/R组大鼠心肌细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与I/R组比较，I/R+Fan3，10mg·kg-1和I/R+VH 20 mg·kg-1组大鼠心肌细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05）（图2和表3）。

2.5 Fan对心肌l/R大鼠心肌细胞SOD活性、GSH和MDA含量的影响

与假手术组比较，I/R组大鼠心肌细胞中SOD活性和GSH含量均显著降低（P＜0.05），MDA含量显著升高（P＜0.05）；与 I/R 组比较，I/R+Fan 3，10 mg·kg-1和I/R+VH 20 mg·kg-1组大鼠心肌细胞中SOD活性和GSH含量均显著升高（P＜0.05），MDA含量显著降低（P＜0.05）（表4）。

2.6 Fan对心肌l/R大鼠心肌细胞活化胱天蛋白酶3、Bax、Bcl-2和c-Myc蛋白表达水平的影响

与假手术组比较，I/R组大鼠心肌细胞中活化胱天蛋白酶3和Bax蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），Bcl-2和c-Myc蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与I/R组比较，I/R+Fan 3，10 mg·kg-1和I/R+VH 20 mg·kg-1组大鼠心肌细胞中活化胱天蛋白酶3和Bax蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），Bcl-2和c-Myc蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）（图3）。

Fig.2 Effect of Fan on cardiomyocyte apoptosis in l/R rats（TUNEL staining）.See Tab.1 for the rat treatment.Arrows show apoptotic cells.

Tab.3 Effect of Fan on cardiomyocyte apoptosis in l/R rats

Tab.4 Effect of Fan on SOD activity，GSH and MDA content of myocardial cells in l/R rats

2.7 Fan对心肌l/R大鼠心肌细胞P38 MAPK和ERK1/2磷酸化水平的影响

图4结果显示，与假手术组比较，I/R组大鼠心肌细胞中P38和ERK1/2的磷酸化水平均显著升高（P＜0.05）；与I/R组比较，I/R+Fan 3和10 mg·kg-1和I/R+VH 20 mg·kg-1组大鼠心肌细胞中P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化水平均显著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of Fan on protein expressions of cleaved-caspase 3，Bcl-2，Bax and c-Myc in cardiomyocytes of l/R rats by Western blotting.See Tab.1 for rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=9.＊P＜0.05，compared with sham group；#P＜0.05，compared with I/R group.

Fig.4 Effect of Fan on phosphorylation of P38 mitogenactivated protein kinase（P38 MAPK）and extracellular regulatory protein kinase 1/2（ERK1/2） in cardiomyocytes of l/R rats by Western blotting.See Tab.1 for rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=9.＊P＜0.05，compared with sham group；#P＜0.05，compared with I/R group.

3 讨论

本研究发现，Fan升高心肌I/R大鼠LVSP和MAP水平，降低Mb和CK-MB含量，减轻心肌损伤，降低心肌细胞凋亡率，升高心肌细胞中SOD活性和GSH水平，降低心肌细胞中活化胱天蛋白酶3和Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2和c-Myc蛋白表达水平降低，心肌细胞中P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化，提示Fan对心肌I/R大鼠具有一定的保护作用。

心血管疾病在世界范围内普遍存在且死亡率高［10］。已有研究表明，心肌I/R大鼠的LVSP和MAP水平均明显降低，CK-MB含量升高［11］。本研究结果表明，Fan处理后，LVSP和MAP均升高，Mb和CK-MB含量均降低。因此，Fan可改善心肌I/R大鼠的心脏功能。

心肌I/R伴随持续的I/R损伤和内质网应激诱导的心肌细胞凋亡［12-13］。细胞凋亡是心肌I/R损伤的重要病理过程，凋亡水平决定了心肌I/R损伤的严重程度［14］。LIU等［15］研究发现，在心肌I/R期间，心肌细胞的凋亡导致心肌细胞的丢失并直接影响心脏功能。本研究结果显示，Fan处理后，心肌细胞凋亡率降低，说明Fan可缓解心肌I/R大鼠心肌细胞凋亡。

氧化应激是导致I/R损伤的主要因素之一［16］。本研究结果显示，Fan处理后，SOD活性和GSH含量升高，MDA含量降低。MDA是脂质过氧化的最终产物，已用于评估I/R心肌的氧损伤；SOD活性和GSH/氧化型GS率水平用于评估组织过氧化损伤［17］。生理上，ROS通过SOD变为过氧化氢或被抗氧化剂分子如GSH还原。然而，当ROS量超过酶抗氧化能力时，发生氧化应激。这种变化可能导致不饱和脂肪经历脂质过氧化作用，从而加剧心肌损害［18］。因此，Fan可缓解心肌I/R引起的氧化损伤。本研究还发现，Fan处理后，活化胱天蛋白酶3和Bax蛋白表达水平降低，Bcl-2和c-Myc蛋白表达水平升高。胱天蛋白酶3作为凋亡过程中的主要末端切割酶，参与DNA修复和基础完整性，Bcl-2通过抑制线粒体破裂、胱天蛋白酶3活化和Bax细胞毒性来防止细胞凋亡，而c-Myc可通过激活Bax诱导细胞色素c从线粒体释放［19］。这说明Fan抑制I/R大鼠心肌细胞线粒体氧化损伤。

包括 P38 MAPK，ERK1/2和JNK在内的MAPK具有广泛的生物学功能，如细胞增殖、基因表达、分化、有丝分裂和凋亡［20］。研究表明，P38的激活发生在I/R过程中，抑制P38 MAPK活化可保护心肌线粒体免受I/R损伤［21］。在心肌I/R过程中，作为一种早期的适应性机制，AMPK在缺血性心肌中被激活，而这种固有的AMPK激活在预防心脏损伤中具有有益作用［22］。本研究结果显示，Fan处理后，P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化水平降低，提示Fan可抑制P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化，从而保护心肌免受I/R损伤。

VH为钙离子拮抗剂，有扩张冠状动脉、增加冠脉血液通过量、减缓心肌兴奋性和房室传导、抗心律失常的作用，常用于心绞痛和高血压治疗。但使用时会出现上腹部不适、疼痛、灼热感、食欲下降、恶心、呕吐和泛酸水等副作用。不可否认的是，VH已被公认为快速、强效的心肌I/R的保护剂，在药效研究中常被作为心肌缺血在损伤的阳性对照药物。本文研究发现，Fan与VH一样可抑制I/R大鼠心肌细胞凋亡和线粒体氧化损伤，抑制P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化。

综上所述，Fan能抑制P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化，缓解心肌I/R大鼠心肌细胞凋亡和线粒体损伤，为Fan应用于临床治疗心肌缺血引起的心血管疾病提供了实验依据。