奶粉中克罗诺肠杆菌属能力验证结果分析

刘霓 赵虹 马妮 董慧明 种婷 胡嵩 魏文霞

摘 要：目的：本次奶粉中克罗诺肠杆菌能力验证主要为夏季乳粉检验任务做准备。方法：采用

GB 4789.40-2016法和MALDI-TOF-MS法进行测定。结果：code27未检出克罗诺肠杆菌，code28检出。结论：在结果一致的前提下，MALDI-TOF-MS方法在时效性上更加优于传统方法。

关键词：克罗诺肠杆菌;能力验证;GB 4789.40-2016;MALDI-TOF-MS

Abstract：Objective： The proficiency testing is prepared for the job of powdered infant formula testing. Method：

GB 4789.40-2016 and MALDI-TOF-MS method were used for determination. Results： Code 27 not detected， code 28 detected. Conclusion： In the same condition MALDI-TOF-MS method is more faster compared with conventional method.

Key words：Cronobacter spp; Proficiency testing; GB 4789.40-2016; MALDI-TOF-MS

中图分类号：TS252.7

2008年，Iversen重新划分了克罗诺肠杆菌属，该菌属含有包含阪崎肠杆菌在内的7个种[1]。它广泛存在于自然界，在牛奶、肉制品、蔬菜、婴幼儿配方乳粉等食品中都有检出[2]。该菌可以在干燥的条件下存活，低于2个月婴儿成为了该菌的易感人群[3]。夏季也成为了婴幼儿感染克罗诺肠杆菌的高峰季节。本次考核为中国食品药品检定研究院组织的NIFDC-PT-247奶粉中克罗诺肠杆菌能力验证，是验证实验室检验能力的一次重要考核。同时也为迎接夏季的乳粉检验任务做好准备工作。本次考核采用了GB 4789.40-2016国标法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）两种方法同时进行验证。近年来，MALDI-TOF-MS方法在食品检测、食源性微生物鉴定方面得到了广泛的应用。越来越多的国家标准也引进了MALDI-TOF-MS方法[4-7]。

1 材料与方法

1.1 材料

中国食品药品检定研究院2020年奶粉中克罗诺杆菌考核样品NIFDC-PT-247 code27、code28。

1.2 培养基和试剂

缓冲蛋白胨水购自BD公司;改良月桂基胰蛋白胨肉汤购自万古霉素购自广东环凯微生物科技有限公司;阪崎肠杆菌显色培养基购自科玛嘉公司;胰蛋白胨大豆琼脂购自北京陆桥技术有限公司;API 20E及氧化酶试剂购自法国梅里埃公司。

1.3 仪器

MALDI-TOF-MS 德国布鲁克公司。

1.4 试验方法

1.4.1 样品处理

将考核样品的西林瓶打开，将小球加入到已预热至44 ℃900 mL灭菌BPW增菌液中，充分溶解。然后将相同编码的乳粉样品加入到上述BPW增菌液中，充分均质混匀。

1.4.2 前增菌与增菌

将两份样品的BPW增菌液于（36±1）℃培养（18±2）h。轻轻摇动前增菌液后，分别移取1 mL转种于10 mLST-Vm肉汤，于（44±0.5）℃培养（24±2）h。

1.4.3 分离

将上述选择性增菌液划线于阪崎肠杆菌显色平板（36±1）℃培养（24±2）h。挑取5个可疑菌落，划线接种于TSA平板，于（25±1） ℃培養（48±4）h。

1.4.4 传统生化方法鉴定

挑取TSA上黄色菌落，进行革兰氏染色，按照API 20E说明，进行生化鉴定。

1.4.5 MALDI-TOF-MS微生物鉴定

分别挑取TSA和阪崎肠杆菌显色平板上单个可疑菌落涂抹于MALDI-TOF-MS 靶板上，加入1 μL70%甲酸，干燥后，加入1 μLHCCA，待干燥后，放入仪器中检测。

2 结果与分析

2.1 分离结果

Code27样品在阪崎肠杆菌显色平板上的菌落形态近于无色，圆形，中等大小，未表现出特有菌落形态;code28样品在在阪崎肠杆菌显色平板上的菌落形态为蓝绿色，圆形，中等大小，具有克罗诺肠杆菌的特有菌落形态。

2.2 传统生化方法（API 20E）鉴定结果

挑取code28的5个可疑菌落接种于TSA培养后，进行革兰氏染色，染色结果为革兰氏阴性菌;进行生化鉴定，5个菌落鉴定结果一致，结果如表1所示，code28样品检出克罗诺肠杆菌;鉴定分值为99.9%。

2.3 MALDI-TOF-MS结果

挑取3个阪崎肠杆菌显色平板上可疑菌落和3个TSA上黄色可疑菌落分别进行MALDI-TOF-MS鉴定，与系统中菌库进行比对后，均属于克罗诺肠杆菌属。（见图1）。

3 讨论

参加本次奶粉中克罗诺肠杆菌能力验证，有效提高了本实验室关于克罗诺肠杆菌属的检验能力。本次实验分别选用了传统方法（生化实验）和当代新先进方法（MALDI-TOF-MS）对样品进行检测。两种方法检验结果一致，在检验时效性上看，传统方法整个实验过程历时约为135 h，而MALDI-TOF-MS方法在显色培养基上长出可疑菌落后基本就可以鉴定是否含有目标菌，大约耗时43 h，仅为传统实验所需时间的1/3，由此可以看出MALDI-TOF-MS方法的时效性更强。从检验的结果来看，两种方法鉴定的结果一致，code27克罗诺肠杆菌属为阴性，code28为阳性，但MALDI-TOF-MS方法同时快捷的鉴定出所掺杂的干扰菌为大肠埃希式菌和奇异变形杆菌，能更好地确认试验的准确性。综上所述，MALDI-TOF-MS方法在一定程度上优于传统的检验方法，大大地缩短了检验的时间。

参考文献：

[1]Iversen C，Mullane N，McCardell B，et al.Cronobacter gen. nov.， a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii， and proposal of Cronobacter sakazakii gen. nov.， comb. nov.， Cronobacter malonaticus sp. nov.， Cronobacter turicensis sp. nov.， Cronobacter muytjensii sp. nov.， Cronobacter dublinensis sp. nov.， Cronobacter genomospecies 1， and of three subspecies， Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis subsp. nov.， Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis subsp. nov. and Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi subsp. nov[J].Int J Syst Evol Microbiol，2008，58（6）：1442–1447.

[2]Hunter C J，Bean J F.Cronobacter： an emerging opportunistic pathogen associated with neonatal meningitis， sepsis and necrotizing enterocolitis[J].J Perinatol，2013，33（Suppl 1）：581-585.

[3]Iversen C，Forsythe S J.Risk profile of Enterobacter sakazakii， an emergent pathogen associated with infant milk formula[J].Trends Food Sci Technol，2003，14（11）：443-454.

[4]杨祖顺，汤晓召，邹颜秋硕，等.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法鉴定食品中金黄色葡萄球菌[J].食品安全质量检测学报，2017，8（10）：

3710-3714.

[5]赵红阳，吕 佳，卢 雁，等.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对阪崎肠杆菌的鉴定[J].中国微生态杂志，2013，25（5）：541-547.

[6]中华人民共和国质量监督检验检疫总局.SN/T 3872-2014 出口食品中四种致病菌检测方法MALDI-TOF-MS法[S].北京：中国标准出版社，2014.

[7]中华人民共和国质量监督检验检疫总局.GB/T 33682-

2017基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则[S].北京：中国标准出版社，2017.

作者简介：刘 霓（1986—），女，碩士，工程师;研究方向为食品微生物。