高效液相色谱法同时检测凉茶中头孢克洛和头孢呋辛酯

温颖婉 陈钰婷 黎艳

摘 要：目的：建立高效液相色谱法检测凉茶中头孢克洛和头孢呋辛酯的方法。方法：样品加入甲醇，超声提取，过滤，用Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱分离，以0.2 mol·L-1磷酸二氢铵-甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长278 nm，光谱扫描波长范围：0～400 nm，进行定性和定量分析。结果：头孢克洛和头孢呋辛酯检出限（3倍信噪比）分别为1.9、4.5 ?g·mL-1，定量下限（10倍信噪比）分别为6.3、15.0 ?g·mL-1，线性相关系数均>0.999 0，平均回收率为98.6%～108.7%，相对标准偏差为0.4%～3.3%。结论：该方法简单、快速、灵敏，可用于凉茶中2种头孢菌素的同时筛查。

关键词：高效液相色谱法;头孢克洛;头孢呋辛酯;凉茶

Abstract：Objective： To establish a method for determination of cefaclor and cefuroxime axetil in herbal tea by high performance liquid chromatograph （HPLC）. Methods： The samples were added with methanol， extracted by ultrasound， filtered， separated by a Gemini C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， eluted with ammonium dihydrogen phosphate and methanol（0.2 mol·L-1） as mobile phase， with flow rate of 1.0 mL·min-1， detection wavelength of 278 nm， spectral scanning wavelength range of 0～400 nm. Results： The detection limit of cefaclor and cefuroxime axetil（S/N=3） was 1.9 and 4.5 μg·mL-1，the lower limit of quantification （S/N=10） was 6.3 and 15.0 μg·mL-1，the linear correlation coefficient was greater than 0.999 0， the average recovery was 98.6%～108.7%， and the relative standard deviation was 0.4%～3.3%. Conclusion： The method is simple， rapid and sensitive， and can be used for simultaneous determination of two cephalosporins in herbal tea.

Key words：High performance liquid chromatography; Cefaclor; Cefuroxime axetil; Herbal tea

中圖分类号：TS272.7

凉茶是岭南人民根据当地多雨潮湿的气候特点和水土特性，在长期预防暑热、疾病的过程中，以中医养生理论为指导，中草药为基础，研制总结出的一类具有清热解毒、生津止渴等功效的饮料总称[1]。若凉茶中随意加入药物成分，饮用者易在不知情的情况下和其他药物同时服用，导致用量难以判断，危害性极大。国家将其列为食品来管理，按照规定严禁添加药物成分。

目前，针对凉茶中非法添加化学药物的相关研究较多，如解热镇痛类药物、磺胺类药物、喹诺酮类药物、四环素类药物都已建立非法添加成分的高效液相色谱测定方法[2]，但头孢菌素类药物的非法添加检测却较少。头孢菌素属于β-内酰胺类抗生素，是一种种类广泛的抗生素，在现有的抗生素种类中使用普遍，该类药物由于具有抗菌谱广、抗菌活性强等特点而广泛用于治疗各种感染性疾病[3]，已成为临床上常用的抗感染药物，如头孢克洛、头孢呋辛酯等。本文采用高效液相色谱法同时测定凉茶中头孢克洛和头孢呋辛酯，为凉茶中非法添加化学药物检测的种类完善，建立简便有效的检验方法，进一步促进凉茶产品的安全规范，提高从业者守法经营意识，提升行业规范经营水平。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（安捷伦A1200，二极管阵列检测器），Gemini C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm，美国Phenomenex公司）;ULUP-IV-20T超纯水机（中国优普公司）;标准物质头孢克洛、头孢呋辛酯（中国食品药品检定研究院）;供试品均为市售宣称具有清热解毒功效的凉茶，共25种;甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯;实验用水均为超纯水。

1.2 液相色谱条件

色谱柱：Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;检测波长：278 nm;柱温：40 ℃;流速：1.0 mL·min-1;进样量：10 μL;光谱扫描波长范围：0～400 nm;流动相A为0.2 mol·L-1磷酸二氢铵溶液，流动相B为甲醇溶液，流动相梯度洗脱，程序条件见表1。

1.3 分析步骤

1.3.1 混合标准系列溶液的制备

分别精密称取头孢克洛、头孢呋辛酯适量，用甲醇溶解稀释到一定体积，配成混合标准储备液，两种标准物质浓度分别为25 μg·mL-1和50 μg·mL-1。用甲醇分别稀释0、1、2、5、10和20倍，吸取上述浓度混合溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱峰面积，绘制标准曲线。

1.3.2 供试品溶液的制备

精密量取样品5 mL于10 mL具塞比色管中，加入甲醇溶液至刻度，振摇，超声提取30 min，取出后冷却至室温。浑浊溶液可取适量3 000 r·min-1离心10 min。上清液经微孔滤膜过滤（0.45 ?m，有机相），取滤液作为待测液。

2 结果与分析

2.1 流动相选择分别考察0.68%磷酸二氢钾-乙腈溶液和0.2 mol·L-1磷酸二氢铵-甲醇溶液作为流动相对分离度的影响，结果显示，待测物质对乙腈亲和度高，保留时间较短，凉茶中成分复杂，待测峰分离度较差，而磷酸二氢铵-甲醇系统可获得理想的峰图，故选择0.2 mol·L-1磷酸二氢铵-甲醇溶液。

2.2 专属性试验

在上述优化色谱条件下，分别取浓度为25 μg·mL-1的头孢克洛对照品溶液、浓度为50 μg·mL-1的头孢呋辛酯对照品溶液、供试品溶液和加标回收溶液进样，获得相应的色谱图（图1），由图可见，待测物质各主成分分离良好，在其相应保留时间附近无干扰峰。经二极管阵列检测器同时获得待测物质光谱图（图2），若供试品在同一保留时间里出现峰，可用于判定是否为待测物质。

注：峰图从左至右依次为头孢克洛、头孢呋辛酯A、头孢呋辛酯B。

2.3 检出限

选取待测标准溶液，利用仪器自动进样，在1.2的仪器条件下，对系列混合标准溶液的进行测定，以标准溶液质量浓度x与仪器色谱响应峰面积y进行线性回归（其中头孢呋辛酯以头孢呋辛酯A、B异构体峰面积之和进行计算）。结果显示，头孢克洛和头孢呋辛酯分别在1.25～25.00 ?g·mL-1、2.5～50.0 μg·mL-1质量浓度范围内，相关系数分别为0.999 0和0.999 9，线性关系均良好，回归方程分别为y=7 494.4x+20 650和y=16 563x-17 196。以3倍信噪比（S/N=3）对应的质量浓度计算检出限分别为1.9 μg·mL-1和4.5 μg·mL-1，以S/N=10计算定量下限分别为6.3 μg·mL-1和15.0 μg·mL-1，完全满足含量分析的要求。

2.4 方法回收率

取空白样品分别精密量取混合标准系列溶液适量，分别配成低、中、高3个浓度（头孢克洛浓度分别为1.25、2.50、12.50 μg·mL-1，头孢呋辛酯浓度分别为2.5、5.0、25.0 μg·mL-1），每个浓度平行测定3份，2种标准物质回收率为98.6%～108.7%，相对标准偏差（RSD）为0.4%～3.3%。

2.5 方法精密度试验

取低、中、高水平3个浓度的混合标准溶液，连续进样6次，测定2种标准物质的峰面积RSD范围为0.1%～2.0%。

2.6 重复性试验

取2.4项下加入中水平浓度待测物质的供试品溶液，连续进样6次，测定供试品溶液中待测物质含量RSD范围为0.9%～1.4%。

2.7 稳定性试验

取2.4项下加入中水平浓度待测物质的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、16 h和24 h进样测定，并計算各待测物峰面积。结果显示，待测物质峰面积的RSD分别为0.7%与1.8%，表明待测液在24 h内稳定。

2.8 实际样品检测

应用本研究建立的方法实际测定市售凉茶样品25份，其中2份在头孢呋辛酯相应保留时间出现峰图，2份在头孢克洛相应保留时间出现峰图，经进一步与光谱图对照，与待测物质图谱不符，均未检出方法中的待测物质。

3 结论

本研究建立同时测定凉茶中头孢克洛和头孢呋辛酯的方法。该方法在头孢克洛浓度为1.25～25.00 ?g·mL-1，

头孢呋辛酯浓度为2.5～50.0 μg·mL-1范围内线性关系良好，回收率达到比较理想水平，方法简便、重复性强、灵敏度好、准确性高，为凉茶中非法添加化学药物的监督检验提供了有力的技术支撑，严厉打击在食品中非法添加药品的违法犯罪行为，坚决维护消费者的食品安全和生命健康。

参考文献：

[1]王 萍，肖更生，张友胜，等.广式凉茶研究进展[J].食品科技，2010，35（2）：77-80.

[2]温家欣，陈 林，赖宇红，等.高效液相色谱法同时快速测定凉茶中11种非法添加化学药物[J].分析测试学报，2016，35（3）：285-291.

[3]Gu B，Zhou M，Ke X，et al.Comparison of resistance to third-generation cephalosporins in Shigella between Europe-America and Asia-Africa from 1998 to 2012[J].Epidemiol Infect，2015，143（13）：2687-2699.

作者简介：温颖婉（1983—），女，本科，主管中药师;研究方向为药品、食品、化妆品及医疗器械理化检验。