碱胁迫对紫花苜蓿抗氧化酶的影响

韩 阳，邱漫莉，孟 靖，邢晓琳，阮亚男

(辽宁大学 生命科学院，辽宁 沈阳110036)

0 引言

土地盐碱化作为一个限制农业发展生产的全球性问题，已经严重地影响了全球生态稳定及生物多样性.全世界盐碱土地面积占总土地面积10%左右，而且处于不断增多的状态[1]；我国是盐碱土地面积较大的国家之一，排在世界第三位.盐碱土地由于水分流通不畅，使得土壤板结，影响植物吸收营养过程，致使植物生长受到抑制[2].已有研究表明[3，4]，碱胁迫对植物的伤害远远大于盐胁迫的伤害.

紫花苜蓿(Medicago stativa)，多年生草本植物，因其具有蛋白质含量高、适口性好等优良的农业品质而在世界范围内广泛种植[5].紫花苜蓿根系发达，生长三年以上的紫花苜蓿主根可扎入土壤中长达数米，而且侧根众多.这种深而有力的根系使得紫花苜蓿具有保蓄水分，防止水分流失，同时防止土壤侵蚀的作用[6]，强大的根系也使得紫花苜蓿能够适应各种环境条件，具有较强的抗旱、抗热、抗寒能力.目前，由于土地盐碱化、荒漠化与发展畜牧业之间的矛盾越来越突出，因此本文研究了紫花苜蓿在碱胁迫下生理生化反应，以期为紫花苜蓿在盐碱条件下的培育和盐碱地生物治理提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

供试品种为甘农1号紫花苜蓿(Medicago sativaL.).

1.2 方法

1.2.1 碱胁迫处理

选取大小一致，颗粒饱满，种皮光滑的紫花苜蓿种子，种植在土壤中；待苗高10 cm时，选取生长健壮、整齐一致的幼苗，定植于以蛭石和珍珠岩混合物为培养基质的花盆中，每盆等距栽种9棵幼苗.随机分为5组，设3次重复.

用Hogland营养液培养定植的幼苗4周后，开始碱胁迫处理.共设5个处理，各处理分别浇灌NaHCO3浓度为0 mmol·L-1、25 mmol·L-1、50 mmol·L-1、75 mmol·L-1、100 mmol·L-1的Hogland营养液，每盆每次200 m L，2 d浇一次，共处理14 d.培养及处理期间每天16 h光照，光强为600μmol·m-2·s-1.温度为(24±2)℃，湿度为(60±5)%.

碱胁迫处理完成后，测定相关生理指标.

1.2.2 指标测定

1.2.3 数据处理

数据处理及方差等统计学分析均由统计学软件SPSS 20.0完成.所有的数据均以三次的平均值±标准差的形式表示(Mean±SD)，检验水平为5%.各处理平均值均以多重比较(LSD)方法检测统计学差异.数据图形的绘制由绘图软件Excel完成.

2 结果与分析

2.1 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿H2O2含量的影响

过氧化氢是活性氧(ROS)重要的代表之一，逆境条件可诱导植物细胞内H2O2的产生和积累，H2O2的含量在一定程度上可以间接反应植物受损伤的程度.由图1可见，随着碱处理浓度的增加，H2O2含量呈现先下降再上升的趋势.25、50 mmol·L-1处理组H2O2含量显著低于对照组，分别为对照的81.95%和57.88%.100 mmol·L-1处理组H2O2含量显著高于对照，是对照的1.095倍，说明100 mmol·L-1时植物受到的碱胁迫损伤最大.

注：不同字母表示0.05水平上差异显著.下图同.图1 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿H 2O 2含量的影响

2.2 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿超氧自由基产生速率的影响

图2 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿·产生速率的影响

2.3 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿MDA含量的影响

在逆境环境下，植物体内过量的氧自由基会引起膜脂过氧化反应，产生膜质过氧化物——丙二醛，会与蛋白质等发生反应，使其丧失功能.所以，MDA的含量可以间接反应植物细胞膜受损的程度.由图3可以看出，随着碱处理浓度的增加MDA含量呈先上升后下降的趋势，25 mmol·L-1处理组的CAT活性显著升高.50 mmol·L-1和100 mmol·L-1处理组的MDA含量分别较CK高1.026%和1.89%.由此说明，在不同浓度的碱胁迫下，紫花苜蓿受到不同程度的损伤，均产生MDA.

2.4 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿相对电导率的影响

相对电导率在一定程度上也可以反映植物受伤害的程度.植物受到的伤害越大，膜质受损越严重，细胞膜透性增大，引起细胞液内离子流动，导致相对电导率的增高.在碱胁迫下，紫花苜蓿相对电导率呈上升趋势，在各个浓度组之间差异显著分别较CK组增加了2.69倍、3.82倍和4.44倍.说明在不同浓度的碱胁迫下，紫花苜蓿的生物膜都受到了破坏，尤其在高浓度胁迫下，生物膜破损严重，大量电解质外泄，相对电导率显著增加(见图4).

图3 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿MDA含量的影响

图4 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿相对电导率的影响

2.5 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿脯氨酸含量的影响

脯氨酸是植物体内一种重要的渗透调节物质，可以保护生物大分子、保护细胞膜系统[17]，防止细胞受损.脯氨酸的积累是植物盐碱胁迫下自身出现的一种防御性行为，也是其遭受逆境胁迫的一种信号[18].如图5所示，随着处理液浓度的增加，脯氨酸含量呈逐渐增加的趋势，且各处理间差异显著，100 mmol·L-1处理组脯氨酸含量最高，是对照组的9.77倍，说明高浓度碱胁迫下植物会产生大量的脯氨酸以缓解植物所受到的损伤.

2.6 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿抗氧化酶活性的影响

图5 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿脯氨酸含量的影响

图6 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿CAT 活性的影响

CAT是生物防御系统的关键酶之一，与植物的呼吸作用及光合作用有着密切的联系，当植物受到伤害时，CAT活性会增加，对细胞起保护作用[20].其主要作用是清除代谢过程中的产生的H2O2，以避免H2O2的积累对细胞的氧化破坏作用.如图6所示，CAT活性随碱浓度升高呈上升趋势，且与CK差异显著，分别是CK的1.81倍、2.35倍和2.44倍.但50 mmol·L-1和100 mmol·L-1两个处理组间差异不显著.说明随着碱浓度的升高，紫花苜蓿细胞膜系统受到损伤，从而产生大量CAT以缓解碱胁迫对植株造成的伤害.

过氧化物酶(POD)是一种能够反映植物体内代谢状况和对外界环境适应性的酶，在植物体内活性较高，逆境能够促使POD活性增高，POD同CAT一样可以清除植物体内积累产生的H2O2.如图7所示，POD酶活性随NaHCO3碱处理浓度的增加，呈现先下降再上升的变化趋势.在碱处理浓度为25、50 mmol·L-1时，POD酶活性显著低于对照组，分别下降33.3%和30%，而100 mmol·L-1碱处理使POD活性上升131.60%，与CK呈现显著差异，说明此时植株受到的损伤最大.

SOD是植物界普遍存在的一种酶，主要作用是防止细胞膜被活性氧和其他过氧化物破坏，逆境条件下，植物可以通过提高SOD的活性，减少氧自由基对细胞造成的伤害，其活性的变化可以反应植物抗逆性的强弱.如图8所示，随着NaHCO3碱处理浓度的增加，SOD酶活性呈现先下降后上升的趋势，对照组的SOD酶活性最高，50 mmol·L-1碱处理组酶活性最低并显著低于对照组，是对照组25.77%.这与王爱霞等人[21]研究NaCl胁迫对构树幼苗SOD酶的影响的变化趋势一致.

2.7 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿叶绿素含量的影响

叶绿素是植物进行光合作用的重要物质，主要起吸收、传递和转化光能的作用，叶绿素含量的多少对植物的光合作用有着重要的影响.在土壤盐胁迫下，植物叶片内的叶绿体会遭到破坏，抑制叶绿素的合成或者促进叶绿素的分解[22].

图7 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿POD活性的影响

图8 不同浓度NaHCO3对紫花苜蓿幼苗SOD酶活的影响

图9 不同浓度NaHCO 3对紫花苜蓿叶绿素含量的影响

如图9所示，随着碱处理液浓度的增加，叶绿素a和叶绿素b均呈现先上升后下降的趋势，各处理组之间差异显著且与对照组有显著差异.当碱处理浓度为25mmol·L-1时，叶绿素a和叶绿素b的含量最高，分别为对照组的1.62倍和1.45倍.而随着碱处理浓度的升高，叶绿素a和叶绿素b的含量逐渐减少，呈下降趋势.实验结果与刘会超等[23]人的研究结果类似.

3 讨论

CAT和POD是植物抗氧化酶系统中的重要组成部分.POD是活性较高的适应性酶，能够反映植物生长发育的特性、体内代谢状况以及对外界环境的适应性，逆境能够促使POD活性增高.CAT也是植物体内一种普遍存在的抗氧化酶，并且是一系列抗氧化酶中的最后一道防线，能够有效清除植物体内过多的过氧化氢.

在25 mmol·L-1和50 mmol·L-1碱胁迫下，H O清除酶CAT和POD活性呈现相反的变化趋势：CAT活性显著升高，POD活性显著下降；与此同时H2O2含量显著下降，MDA含量未出现显著变化.这些现象说明，CAT活性上升是紫花苜蓿响应低浓度碱胁迫的主要方式，也说明在低浓度碱胁迫下，CAT是清除H2O2的主要酶.在100 mmol·L-1碱胁迫下，CAT和POD酶活性均呈现上升趋势，H2O2含量也显著升高，MDA含量和相对电导率也显著增大，说明此时CAT和POD对高浓度的碱胁迫做出响应，清除掉一部分因碱胁迫而诱导产生的H2O2，但是，高浓度碱胁迫引起的氧化伤害已超出了植物的自我修复阈值.

光合作用指植物吸收光能，把二氧化碳和水合成富能有机物，同时释放氧气的过程.叶绿素是植物光合作用的重要元素，主要起吸收、传递和转化光能的作用，是植物生长发育的关键.叶绿素是进行光合作用的物质基础，叶绿素含量的高低在一定程度上可以反映植物光合作用的强弱[22].叶绿素代谢是一个动态平衡过程，盐碱胁迫打破了这种平衡，造成叶绿素含量的变化[25].植物在土壤碱肋迫下，叶绿素结构受到破坏，叶绿素含量发生改变，阻碍植物光合作用的正常进行，影响植物的生长.上述实验结果说明，高浓度碱胁迫处理可使紫花苜蓿叶绿素的含量下降，但在胁迫的不同阶段，叶绿素的反应不同.当碱处理浓度为25 mmol·L-1时叶绿素含量增加，说明紫花苜蓿可能受到低浓度碱胁迫的影响，通过提高叶绿素的合成，来增强叶片的光合作用以适应环境胁迫.而随着碱胁迫浓度的增加，叶绿素含量开始逐渐降低，表明紫花苜蓿受到碱胁迫的负影响增强，超过紫花苜蓿自我调节能力的极限，碱胁迫对叶绿素合成系统造成了一定的破坏，导致叶绿素含量降低.这与崔禄[26]的实验结果一致.

脯氨酸是最重要和有效的有机渗透调节物质，本质为游离氨基酸，具有很高的水溶性.几乎所有的逆境胁迫都会造成植物体内脯氨酸的积累，脯氨酸的积累会增强植物对环境的适应能力[27]，植物体内的脯氨酸含量可以反应植物耐受能力的高低，可以保护细胞膜系统，防止植物过分失水死亡.随着碱胁迫程度的增强，脯氨酸含量也在持续增加，脯氨酸作为一种渗透调节物质，提高了紫花苜蓿对碱胁迫的抗性.

4 结论

当植物遭受碱胁迫时，植物的各种生理代谢活动都会受到影响.碱胁迫打破了紫花苜蓿体内活性氧代谢系统的平衡，增加了活性氧的产量，活性氧大量累积，细胞自身的防御保护系统会启动，诱导了SOD、CAT、POD活性的变化，进而清除氧自由基和过氧化物，保护细胞结构不被破坏.碱胁迫下，植物细胞膜容易发生破裂，导致胞液外渗，相对电导率显著增大.实验结果表明，高浓度碱胁迫会对紫花苜蓿的生长造成一定的影响，相对电导率、脯氨酸含量、POD以及SOD活性均随着碱浓度的升高而显著升高，紫花苜蓿对低浓度的碱胁迫的耐受性更强.