轮型钼簇对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

户晶晶，王瑞芳，王 力，丁小梅，李 月

(集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021)

0 引言

糖尿病是一种严重的慢性疾病，其标志性异常是高血糖[1]。α-葡萄糖苷酶是治疗糖尿病的一种靶酶，它可通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性来降低餐后血糖水平。阿卡波糖是市面上常用的一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，能有效控制餐后血糖水平的升高，但长期服用会出现腹泻、恶心、呕吐等不良反应[2-3]。近年来，通过大量科学研究，人们已筛选出多种抑制效果好、副作用低的α-葡萄糖苷酶抑制剂，如：Zhang等[4]从菠萝蜜(Artocarpus heterophyllusLam.)果皮中提取的活性成分对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用；Yang等[5]从何首乌(Polygonummultiflorum)根中提取具有抑制α-葡萄糖苷酶活性成分物质；Wang等[6]合成的新型色酮-靛红衍生物对酵母α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用；Nguyen等[7]从发酵营养肉汤中分离并鉴定出5种新型α-葡糖苷酶抑制剂——腺嘌呤、3-羟基脯氨酸、肌酸酐、烟酸和烟酰胺，且3-羟基脯氨酸和烟酸对大鼠α-葡萄糖苷酶的活性抑制强度大于阿卡波糖。上述研究的都是有机化合物抑制剂，而关于无机化合物抑制剂的研究鲜见报道。本实验组CHI等[8]考察了Keggin型多金属氧酸盐对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，发现过渡金属取代的Keggin型磷钼酸中Na4PMo11VO40抑制效果最好，此研究为设计有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂提供了一个新视角。

多金属氧酸盐(polyoxometalates,POMs)是一类高价多阴离子的金属氧化物[9]，种类丰富多样，性质独特，在催化化学[10]、药物化学[11]、材料化学[12]等领域均有研究。轮型钼簇是一种纳米尺寸的高核化多金属氧酸盐，在分子磁体、生物仿生及纳米功能材料领域[13-14]具有可观的应用前景，是多酸研究的新热点。此外，王川[15]研究发现3种球型高核钼簇对HUVECs细胞的增殖、迁移起到抑制作用，这为治疗阿尔莫兹海默症提供了实验基础。本实验室小组曾研究纯钼簇和有机-无机钼簇对酪氨酸酶的抑制作用[16]，并将其应用于对虾和苹果的保鲜，而高核化轮型钼簇的生物活性研究鲜见报道。

本文拟合成4种高核化的轮型钼簇{(NH4)12[Mo36O108(NO)4(H2O)16]·33H2O，Na5(NH4)16[Mo57Mn6(NO)6O174(OH)3(H2O)24]·44H2O，(NH4)21[H3Mo57V6(NO)6O183(H2O)18]·65H2O，Na3(NH4)12(Mo57Fe6(NO)6O174(OH)3(H2O)24)·76H2O(以下分别简写为Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6)}，并考察其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，为开发新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

酿酒酵母的α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)购自Singma-Aidrich公司(St.Louis，MO，USA)；阿卡波糖购自上海麦克莱恩生化科技有限公司(中国上海)；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)和对硝基苯(pNP)购自北京百灵威科技有限公司(中国北京)；二甲基亚砜、无水碳酸钠，钼酸钠、偏钒酸铵、盐酸、氯化羟胺购自西陇化工股份有限公司；用于化合物合成和酶动力学测试系统的试剂均为分析级，水为超纯水。

SynergyH1全功能酶标记仪器(UnitedStatesBioTekInstrumentCo.，Ltd.，USA)；pH211C型酸度计(北京HanakeTechnologyCo.，Ltd.)；HWS-24电热恒温水浴(上海恒世仪器有限公司，中国上海)。

1.2 实验方法

1.2.1 轮型钼簇化合物的合成及表征

化合物Mo36的合成参考文献[17]稍作修改：11.92g钼酸钠、7.68g盐酸羟胺、4.36g氯化铵、15.2mL3.5%(质量分数)盐酸和150mL水于300mL锥形瓶中混合均匀，70～75 ℃下水浴16h后，反应液趁热过滤，红色滤液冷却后于20 ℃下静置一周，有红色的晶体析出。化合物Mo57Mn6的合成参考文献[18]稍作修改：2.43g钼酸钠、3.68g醋酸锰和0.347g盐酸羟胺溶于100mL水中混合均匀，调pH值至3.0～3.5。室温下搅拌反应3～4h后，过滤反应液，滤液20 ℃下静置半个月，有深红色块状晶体析出。化合物Mo57V6的合成根据文献[17]稍作修改：7.46g钼酸钠、1.19g偏钒酸铵、12.83g盐酸羟胺、9.5mL3.5%(质量分数)盐酸和200mL水于300mL锥形瓶中混合均匀，90 ℃下水浴20h后，过滤反应液，滤液20 ℃下静置一周，有蓝紫色晶体析出。化合物Mo57Fe6的合成根据文献[19]稍作修改：12.00g钼酸钠、9.50g硝酸铁、16.00g盐酸羟胺、12.5mL3.5%(质量分数)盐酸和250mL水搅拌均匀，回流加热，直至冷凝管中有棕色蒸汽回流。反应液趁热过滤，将米色-棕色沉淀物分离出去，滤液保存于敞口的400mL烧杯中，2d后再次过滤，滤液于锥形瓶中5 ℃下密封保存，3～4d后析出褐色晶体。通过红外和紫外/可见光谱对合成的4种轮型钼簇进行结构表征。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶测活体系的建立

α-葡萄糖苷酶测活体系的制备参考文献[20]稍作修改：取10μL配制于磷酸盐缓冲液中的酶液加入133μL0.1mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.8)中，再加入溶于DMSO的效应物7μL，混合均匀后，37 ℃下孵育10min。然后加入20μL溶于磷酸盐缓冲液(pH=6.8)的5mmol/L底物pNPG，37 ℃下再孵育20min后，用170μL的0.1mmol/LNa2CO3淬灭反应，反应液于405nm波长下测定吸光度值。

1.2.3 4种轮型钼簇对α-葡萄糖苷酶的抑制效果

效应物(Mo36，Mo57Mn6，Mo57V6，Mo57Fe6)对α-葡萄糖苷酶的抑制效果是在测活体系中，固定α-葡萄糖苷酶为5U/mL，底物pNPG浓度为5mmol/L，测定效应物在不同浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。每个实验重复5次，测定效应物在不同浓度下对应的相对剩余酶活力。以效应物浓度为横坐标、相对剩余酶活力为纵坐标作图，当相对酶活力为50%时，所对应的抑制剂浓度即为IC50值。剩余酶活力随抑制剂浓度变化的计算公式为：抑制/%=(Ab-As)/Ab×100。式中：Ab为空白组没有添加抑制剂时反应体系测得的吸光度值；As为样品组不同浓度抑制剂下反应体系测得的吸光度值。

1.2.4 4种轮型钼簇对α-葡萄糖苷酶的抑制机理

效应物(Mo36，Mo57Mn6，Mo57V6，Mo57Fe6)对α-葡萄糖苷酶抑制机理研究是在上述α-葡萄糖苷酶测活系统中，以5mmol/LpNPG作为底物，将α-葡萄糖苷酶的浓度分别配制为5，4，3，2，1U/mL，监测不同浓度的效应物对α-葡萄糖苷酶和底物的水解反应的影响。

1.2.5 4种轮型钼簇对α-葡萄糖苷酶的抑制类型

效应物(Mo36，Mo57Mn6，Mo57V6，Mo57Fe6)对α-葡萄糖苷酶抑制类型研究，同样在上述的α-葡萄糖苷酶测活体系中，固定酶为5U/mL，将底物pNPG的浓度分别配制为5，3.9，2.8，1.7，1.1mmol/L，监测不同浓度的效应物对α-葡萄糖苷酶和底物的水解反应的影响。

1.2.6 数据处理

数据的统计及处理采用SPSSStatistics17.0软件，图形的绘制采用OriginPro8.5软件。

2 结果与分析

2.1 4种轮型钼簇的表征结果

表1 化合物(Mo36，Mo57Mn6，Mo57V6，Mo57Fe6)的红外表征数据

紫外光谱测定结果显示，4种化合物在209 nm 和232 nm波长处均出现了多金属氧酸盐特征峰，这符合杂多酸化合物约在200 nm和260 nm处有特征吸收峰的特点。

4种钼簇化合物的三维晶体结构以Polyhedral结构形式显示[17,19]，如图1所示。4种轮型钼簇化合物分别有不同的结构形式，Mo36是同核簇，Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6是异核簇。

2.2 效应物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6为效应物，随效应物浓度的增加相对剩余酶活力逐渐下降。Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6对α-葡萄糖苷酶的IC50值分别为(0.229±0.002 48)，(0.212±0.001 07)，(0.039 4±0.001 67)，(0.025 9±0.000 328)mmol/L，阿卡波糖的IC50=64.309 mmol/L，故4种效应物对α-葡萄糖苷酶均表现为高效，且对α-葡萄糖苷酶的抑制效果依次为Mo57Fe6>Mo57V6>Mo57Mn6>Mo36。4种化合物中的轮型Mo57钼簇外部框架相对于Mo36较大，这可能是导致Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6对α-葡萄糖苷酶抑制效果好于Mo36的原因之一。Prudent等[22]研究发现，多金属氧酸盐对蛋白激酶CK2抑制作用主要取决于POM结构，随着POM大小和电荷的增大，抑制效果增加；同时指出，属于同一POM家族的化合物具有类似的活性，此结论与本实验结果具有相似性。然而，过渡金属取代的3种轮型钼簇表现不同的抑制效果，可能是金属离子对α-葡萄糖苷酶的活性具有一定的影响。

2.3 效应物对α-葡萄糖苷酶的抑制机理

4种钼簇化合物(Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6)对α-葡萄糖苷酶抑制机理的判定是以体系中反应速率为纵坐标，酶活力为横坐标作图，结果如图2所示。可见4种效应物的机理图具有高度相似性。然而，在每组图中，5条曲线对应的效应物浓度随效应物对α-葡萄糖苷酶抑制效果的不同而改变。图2中的曲线均经过原点，随着效应物浓度的增加，每组曲线的斜率均逐渐减小。综上所述，Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6对α-葡萄糖苷酶均是可逆抑制机理，此结果与谢乐芳等[23]报道的Dawson型多金属氧酸盐对酪氨酸酶的机理型研究结果具有一致性。效应物分别与α-葡萄糖苷酶以非共价形式结合，从而降低酶的活性。此外，可以通过透析、过滤等物理方法除去效应物，从而使酶的活性恢复[24]。

2.4 效应物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型

酶反应速率倒数对底物pNPG浓度倒数作Lineweaver-Burk双倒数图，通过Lineweaver-Burk图测定每种测试效应物对酶的抑制类型。Mo36对α-葡萄糖苷酶的抑制类型如图3a所示，直线1-5相交于Y轴，随着Mo36浓度变大，米氏常数(Km)变大，最大反应速率(vmax)不变，表明效应物Mo36对α-葡萄糖苷酶是竞争型抑制。效应物Mo36和底物(pNPG)竞争型地与α-葡萄糖苷酶的结合部位结合，从而影响了底物和酶的正常结合[25]。通过绘制Dixon图计算抑制常数KI=0.100 mmol/L。

Mo57Mn6对α-葡萄糖苷酶的双倒数图以及Dixon图如图3b所示。图3中的曲线相交于第Ⅱ象限，随着Mo57Mn6浓度的增加，曲线的斜率逐渐增大。同时，曲线相交于Y轴的纵向截距(1/vmax)逐渐增加，相交于X轴的横向截距(1/Km)逐渐减少。表明Mo57Mn6对α-葡萄糖苷酶是混合型抑制，通过计算得出抑制常数KI值和KIS值分别为0.156，0.319 mmol/L。抑制常数越小，抑制剂对酶的结合亲和力越强。结果显示KI值小于KIS值，表明效应物Mo57Mn6主要是以与游离酶结合的方式与α-葡萄糖苷酶结合[26]。

Mo57V6、Mo57Fe6两种效应物对α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk双倒数图具有相似性，如图3c、图3d所示。每组图中的5条曲线交点即不在X轴也不在Y轴。Mo57V6、Mo57Fe6对α-葡萄糖苷酶的抑制类型均表现为混合型抑制。通过二次作图，得出Mo57V6抑制常数分别为KI=0.042 9 mmol/L，KIS=0.026 7 mmol/L。Mo57Fe6的抑制常数分别为KI=0.017 2 mmol/L、KIS=0.008 11 mmol/L。两种效应物的KI值均大于KIS值，表明Mo57V6、Mo57Fe6主要是与酶-底物复合物结合。

3 结论

通过酶动力学研究发现：4种轮型钼簇Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6对α-葡萄糖苷酶均具有较好的抑制效果，且Mo57Fe6的抑制效果最好，其IC50=(0.025 9±0.000 328)mmol/L；4种轮型钼簇对α-葡萄糖苷酶均为可逆性抑制，其中Mo36是可逆竞争型抑制，Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6为可逆混合型抑制。在了解了4种轮型钼簇对α-葡萄糖苷酶的抑制效果、抑制机理及抑制类型的基础上，接下来还需进一步研究抑制剂与酶蛋白之间的结合模式，进而为研究开发新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂提供理论基础。