阿魏菇凝集素对小鼠腹腔巨噬细胞免疫活性的影响

刘 阳 许程剑，2* 林 丹 梁鹏娟

（1 四川旅游学院食品学院 成都610100 2 石河子大学食品学院 新疆石河子832000）

凝集素（Lectin）是专一识别糖并与特定结构糖分子可逆、非共价结合的糖蛋白或蛋白质，从植物、动物、微生物中皆可以分离得到[1]。Yoon 等[2]研究发现从韩国槲寄生[Viscum coloratum（Kom.）Nakai]中分离的凝集素具有免疫调节活性，可增强宿主对抗肿瘤的防御系统， 对肿瘤转移的预防和治疗效果与NK 细胞（natural killer，NK）和巨噬细胞的活化相关。研究表明，大量大型真菌均具有一定凝集素活性[3]，可抑制癌细胞增殖，促进机体免疫活性，如阿魏菇[4]、猴头菌[5]、牛樟芝[6]、杏鲍菇[7]等。 在食品领域凝集素一直是各国学者研究的重点[8-10]。

阿魏菇作为目前食用菌中营养含量最高的一种， 其蛋白质含量高达14.9%， 富含不饱和脂肪酸，并含有丰富的维生素及多种矿物质[11]，是食用与药用价值并存的珍贵菌类。 李娜等[12]研究发现食用阿魏菇有助于减轻宫颈癌患者化疗后的不良反应，增强对化疗的耐受力。Gong 等[13]研究发现阿魏菇多糖可提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用，进而增强其免疫活性，达到抗肿瘤的目的。目前鲜有报道显示阿魏菇凝集素的免疫活性。 本文基于真菌凝集素的研究现状， 采用现代分子生物学技术从阿魏菇中分离得到凝集素， 通过凝集素与巨噬细胞的共培养，检测蛋白的免疫生理活性，探讨真菌凝集素在药用真菌中存在的特点和普遍性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿魏菇，采至新疆清河县。 昆明种小鼠，石河子大学动物实验中心。

二乙氨基乙基纤维素52、 琼脂糖凝胶4B，上海圆创生物科技有限公司； 小鼠TNF-α、IL-1 Elisa 试剂盒，北京诚林生物科技有限公司；噻唑蓝MTT 、RPMI-1640 培养基， 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；其它试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

ENK-PRO 型酶标仪， 美国Bioteck 公司；BT-200E 型恒流泵，上海琪特分析仪器有限公司；BSZ160-LCD 型自动部分收集器， 上海琪特分析仪器有限公司；Ultrospec-5300 型紫外分光光度仪，美国Amersham 公司；真空冷冻干燥系统，日本SHIMADZU；BPN-50CH（UV）二氧化碳培养箱，上海一恒公司。

1.3 方法

1.3.1 PFLL 的分离纯化 取湿重200 g 的新鲜阿魏菇， 打浆后加入pH 7.2 的PBS 缓冲液1 000 mL，浸泡1 d，次日8 000 r/min 离心20 min，取上清液。 用硫酸铵沉淀蛋白[14]，过夜后8 000 r/min 离心20 min。取沉淀重新溶解于硫酸铵溶液中，透析2 d，冷冻干燥后得粗品。

将粗品溶解后，过DEAD-52 柱，分别用0.1，0.2，0.3，0.4 mol/L 和0.5 mol/L NaCl 洗脱，于波长280 nm 处测定吸光度值， 按洗脱峰收集合并组分。 过Sepharose 4B 层析柱，收集有峰值的组分，检测凝血活性。 将有凝血活性的组分合并后的凝集素透析，冷冻干燥得到高纯度凝集素PFLL。

1.3.2 小鼠腹腔巨噬细胞的分离 对实验小鼠于3 d 前腹腔注射1 mL 小牛血清。 实验当天颈椎脱臼处死小鼠，于医用酒精中浸泡5 min，打开腹部皮肽， 腹腔注射无血清RPMI-1640 培养基15 mL，轻揉腹部10 min，收集腹腔中的培养基，1 000 r/min 离心5 min， 用无血清RPM I-1640 培养基离心洗涤2 次[15]，再用含血清RPMI-1640 培养基将细胞浓度调整为5×106个/mL。 将调整好的细胞悬液按每孔100 μL 加入96 孔培养板， 每组设3个复孔，于5% CO2培养箱37 ℃培养2 h，吸弃培养液， 除去未贴壁的细胞， 然后加入新鲜的培养基，即巨噬细胞。以不同质量浓度的PFLL（10，20，30，40 μg/mL 和50 μg/mL）与巨噬细胞共培养，于空白组加入无血清培养液10 μL。

1.3.3 小鼠腹腔巨噬细胞增殖活性的检测 提取小鼠腹腔巨噬细胞并将细胞数调整到1×106个/mL。 在培养细胞中加入不同质量浓度的PFLL（0，10，20，30，40 μg/mL 和50 μg/mL）和10 μg/mL LPS，并设置空白对照组和LPS 刺激组（10μg/mL）[15]。每个浓度3 个重复孔，将细胞于5% CO2，37 ℃培养箱中培养48 h。 实验前，每孔分别加入2 μL 5 μg/mL MTT，继续培养6 h。 培养结束后轻扣去除液体培养基， 每孔加入150 μL DMSO， 震荡10 min，于波长570 nm 处测定OD 值。 以OD 值为衡量标准判断细胞增殖情况。 空白对照组为加入无血清培养液10 μL。

1.3.4 NO 生成量的检测 用Griess 重氮化反应法试剂盒检测。 取待测上清100 μL，加入96 孔板中，每孔加50 μL Griess 试剂A，轻轻震荡，反应10 min 后加入50 μL Griess 试剂B，轻轻震荡，反应10 min 后于波长550 nm 处检测OD 值。

1.3.5 O2-生成量的检测 有关O2-生成量的检测，将小鼠分成9 组进行实验。 所有对照组注射无菌PBS （pH 7.2～7.4）。腹腔注射PFLL 溶液。7 d 后收集细胞至24 孔板， 调整细胞数为1×105个/孔，然后依照之前的方法收集贴壁巨噬细胞。 两组巨噬细胞（5×105个/mL）与HBSS（Hank’s 平衡盐溶液）标准液和高铁细胞色素C 的混合物 （80 μmol/mL）共同培养[8]，分别添加或者不添加PMA（1 μg/mL）。 在波长540 nm 处测定OD 值，消光系数=2.1×104/（m·cm）。

1.3.6 TNF-α、IL-1 的检测 依靠酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）测定上述物质。 测定工具为专用试剂盒， 使用方法如下：将试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温，取出所需反应板； 对反应板每孔加入10 μL 标准品、10 μL 样品，每孔再加入40 μL 样品稀释液，轻轻混匀30 s，封住板孔，37 ℃温育30 min。洗板：甩干板内液体，用洗涤液洗涤反应板（48 孔）（20 倍洗涤液，用前应稀释至1 倍），反复洗涤5 次，每孔加入酶，轻轻混匀10 s，37 ℃温育30 min。洗板（洗去未结合的反应物）：甩干板内液体，用洗涤液洗涤反应板，去除水滴；反复洗涤5 次；每孔加入显色液A 50 μL， 再加入显色液B 50 μL， 避光温育15 min；每孔加入100 μL 终止液，轻轻混匀30 s；在30 min 内于波长450 nm 处读取OD 值。 以OD 值为纵坐标， 以标准品浓度为横坐标， 绘制标准曲线。 根据样品的OD 值， 在标准曲线上查出其浓度。

1.3.7 数据分析 所有试验重读3 次， 数据值为平均值±标准偏差（SD）。采用方差分析和t 检验来确定其统计学意义（P≤0.01）。 数据分析和图形绘制用Spass 18.0 和Origin 8.0 软件。

2 结果与分析

2.1 PFLL 的分离和纯化

2.1.1 DEAE-52 离子交换层析洗脱曲线 阿魏菇经硫酸铵沉淀、透析、冷冻干燥等步骤分离出凝集素粗品。将凝集素粗品进行DEAE-52 离子交换层析，建立洗脱曲线。由图1 可知洗脱过程分别在35 min 和95 min 处有两个明显的洗脱峰，收集两部分的洗脱液透析除盐， 通过凝血试验测得35 min 处的洗脱液具有更好的凝血活性， 因此收集35 min 处的洗脱液进一步试验。

2.1.2 Sepharose-4B 亲和层析洗脱曲线 将DEAE-52 离子交换层析35 min 处的洗脱液进行Sepharose-4B 亲和层析， 通过PBS 平衡、D-半乳糖解吸附。 如图2 所示，在210 min 时出现峰值，收集此处洗脱液透析并冷冻干燥得高纯度的阿魏菇凝集素。

图1 PFLL 的DEAE-52 离子交换层析图Fig.1 DEAE-cellulose chromatogram of crude extract PFLL

图2 PFLL 的Sepharose-4B 亲和层析图Fig.2 Sepharose-4B affinity chromatography of PFLL

2.2 PFLL 对小鼠腹腔巨噬细胞增殖活性的影响

MTT 法是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT 的四氮唑环可被活细胞线粒体的SDH 催化形成MTT-甲瓒复合物，该复合物浓度的变化反映了细胞的增殖活性[14]。 为了研究阿魏菇凝集素对巨噬细胞的体外调节作用， 用阿魏菇凝集素同巨噬细胞共培养，根据不同PFLL 添加量时吞噬细胞吸光度大小确定PFLL 对巨噬细胞增殖活性的影响。图3a 显示，添加PFLL 的巨噬细胞增殖活性皆高于空白对照组，表明小鼠腹腔巨噬细胞在PFLL的诱导下增值活性明显提高，且随着PFLL 浓度的升高其增值活性明显增加。 图3b 所示，巨噬细胞增值活性随培养时间的延长而上升， 说明凝集素能促进巨噬细胞的增殖作用， 刺激巨噬细胞进一步分化成熟，使之成为活化的巨噬细胞，从而显著提高其吞噬能力。试验结果显示PFLL 对巨噬细胞增值的影响呈剂量依赖性和时间依赖性。Ajit 等[16]首次发现小麦胚芽凝集素对巨噬细胞有直接影响， 且小麦胚芽凝集素对巨噬细胞增值的影响同样呈剂量依赖性和时间依赖性。

图3 PFLL 对小鼠腹腔巨噬细胞增殖活性的影响Fig.3 Effect of PFLL on proliferation activity in mice peritoneal macrophage

2.3 PFLL 对NO 诱导的剂量依赖性和时间依赖性

由图4a 可知，阿魏菇凝集素刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生NO 的量， 与空白对照组相比，PFLL（20 μg/mL）组出现显著差异。 随着凝集素浓度的升高，巨噬细胞NO 产生量增加。 由图4b 可知，阿魏菇凝集素能够增加LPS 刺激小鼠腹腔巨噬细胞的NO 产生量，与空白对照组相比，从LPS（10 μg/mL）+PFLL（10 μg/mL）组开始随着凝集素浓度的升高，巨噬细胞NO 产生量增加，PFLL 对NO 产生量的影响呈剂量依赖性。 巨噬细胞可受多种细胞因子及LPS 诱导活化，产生并释放大量NO，从而起到抑制或杀伤的作用， 同时还可通过释放溶酶体酶及细胞毒性因子对组织器官造成损害[17]。 在内毒素引起的休克和多脏器功能衰竭中，NO 是重要的炎性介质之一。 有效控制NO 的合成和释放，进一步减轻NO 的细胞毒作用， 对免疫性疾病等的治疗具有重要意义。

图4 PFLL 对小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO 的影响Fig.4 Effect of PFLL on NO secretion in peritoneal macrophage

2.4 PFLL 对O2-生成量的影响

PFLL 诱导巨噬细胞产生O2-的结果如图5 所示。 在已知的O2-生成过程中，PMA 是公认的信号物质。 由图5a 可知， 加入PMA 的PFLL （0～400 mg/kg）溶液诱导巨噬细胞产生O2-的量为18～38 nmol/mg 细胞蛋白， 而未添加PMA 只添加PELL的O2-的量为9～16 nmol/mg 细胞蛋白。 图5b 表明在60 min 后， 经PFLL 处理的小鼠， 巨噬细胞的O2-的生成量比未处理的高150%（P≤0.01）。另外，经PMA 处理的小鼠在各个水平， 巨噬细胞的O2-的生成量都比未处理的高，而仅高40%。由于巨噬细胞是免疫系统中的效应细胞， 活化的巨噬细胞可更加有效地为细胞呈递抗原， 感染期间更好地吞噬外来颗粒， 形成更好的宿主防御机制[18-19]。PFLL 可以增强其吞噬功能，说明在治疗微生物感染和癌症方面，PFLL 具有潜在的应用价值。

图5 PFLL 对小鼠腹腔巨噬细胞生成O2-的影响Fig.5 Effect of PFLL on the production of O2- in mice peritoneal macrophage

2.5 PFLL 对TNF-α 生成量的影响

由图6 可知，PFLL 能够显著增强小鼠腹腔巨噬细胞的TNF-α 产生量， 与空白对照组相比，10 μg/mL 组就出现显著差异。 随其浓度的升高，巨噬细 胞TNF-α 产生量也增加，TNF-α产生量对PFLL 呈剂量依赖性，然而在试验范围均比LPS 组低。 在固定PFLL 浓度下，TNF-α 产生量呈时间依赖性，24 h 后具有显著性差异。TNF-α 主要由单核细胞和巨噬细胞分泌， 它可活化单核细胞和巨噬细胞，提高巨噬细胞的杀伤活性；同时也可通过上调巨噬细胞MHCII 类分子， 提高其抗原递呈能力；还可提高中性粒细胞的吞噬能力，提高超氧阴离子的分泌，增强ADCC 功能[20]。

图6 凝集素对小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α 的影响Fig.6 Effect of Lectin on TNF-α secretion in peritoneal macrophage

2.6 PFLL 对IL-1 生成量的影响

由图7a 可知， 在不同剂量的PFLL 作用下，IL-1 的生成量呈剂量依赖性。 在PFLL 为50 μg/mL 时与LPS 为10 μg/mL 作用， 巨噬细胞产生的IL-1 量接近。 观察图7b 可知，PFLL 诱导IL-1 的产生呈时间依赖性，IL-1 生成量均高于对照组，且60 h 后生成量继续增加。 石玉荣等[21]研究发现共同培养巨噬细胞和肺癌细胞时， 巨噬细胞可促进肺癌细胞增殖， 同时肺癌细胞可增强巨噬细胞IL-1 的表达，抑制细胞自噬。 多个研究[22-24]也表明IL-1 可促进肿瘤细胞增殖。 本试验结果验证了这一结论。

图7 凝集素对小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1 的影响Fig.7 Effect of Lectin on IL-1 secretion in peritoneal macrophage

3 结论

对阿魏菇凝集素提取、 纯化后， 得到纯品PFLL。 测定了PFLL 诱导巨噬细胞对几种细胞因子NO、O2-、TNF-α、IL-1 生成的结果。 在PFLL 的作用下，巨噬细胞产生的NO、O2-、TNF-α、IL-1 显示出剂量依赖性和时间依赖性。 试验结果表明PFLL 可以增强巨噬细胞的免疫活性，并具有潜在的免疫调节的辅助作用。 IL-1 具有抑制细胞生产和杀灭细胞的能力。 TNF-α 直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性， 可促进T 细胞产生各种炎症因子。 上述细胞因子都由活化的巨噬细胞释放。 以上研究一方面为凝集素促进细胞因子在mRNA 水平的表达及其调控奠定了基础， 另一方面对于阿魏菇凝集素的开发和应用提供了理论依据。