滇杨性别相关的SRAP 分子标记

雷 瀚 ，刘 成 ，唐军荣 ，瞿绍宏 ，董章宏 ，李显煌 ，李 斌 ，常晓勇，辛培尧

（1. 西南林业大学 a. 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室；b. 国家林业和草原局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224；2. 农业农村部 科技发展中心，北京 100122；3. 毕节市林业科学研究所，贵州 毕节 551700；4. 昆明市海口林场，云南 昆明 650114）

滇杨Populus yunnanensisDode，是杨柳科Salicaceae 杨属Populus青杨派树种，别名攀枝树、云南白杨，属落叶乔木，雌雄异株树种[1-2]，多分布于云南中部和北部、贵州西部和四川西南部，垂直分布海拔800 ～3 200 m。滇杨是全国乃至世界范围内少有的生长于低纬度高海拔地区的宝贵杨树资源[3-4]，为西南片区中高峡谷的河谷地带主要的栽植树种，对于维持河流两岸生态平衡及涵养水源起到重要作用。因为具有较高的观赏价值，所以常被用于园林绿化和城市绿化当中[5]。但是，在长期的滇杨遗传改良工作中发现，滇杨群体现存雌株稀缺，大多为雄株。而且滇杨成年雌株树下及其附近极少发现幼树。这种现状导致滇杨遗传基础狭窄，不利于滇杨遗传改良工作的进行。滇杨幼苗是否存在雌雄比例严重不平衡，或者幼年雌株由于对环境的不适过早夭亡，从而导致雌株濒危，不得而知。此外，雌雄异株植物在生产上的分别利用，也是近年来研究者关注的重要问题之一。例如：在园林绿化中，银杏雄株相较雌株来说，是更好的选择[6]。以纤维做为收获物的大麻来讲，雄株纤维质量更好，但是雌株的成熟期比雄株更长，如果混合种植，会给生产带来很大的困难[7]；而软枣猕猴桃是一种有很大经济效益的果树，雌株的经济效益明显高于雄株，这就要求我们要多种雌株以此来提高经济效益[8]。滇杨雌雄株具有不同的特点，在生产上区别种植，才能充分发挥不同性别植株各自的生产潜力。然而，如同大多数雌雄异株植物一样，滇杨直到开花前，其性别不可辨别，极大的阻碍了对其性别相关内容的研究进程。因此，急需找到一种能快速且准确的方法来鉴别早期滇杨性别。

目前，采用传统方法针对成年植物个体进行性别鉴定的方法有外部形态、生理代谢、同工酶、特异蛋白的差异等[9-12]。相关研究为雌雄异株植物的早期选择提供了一定的理论基础与实践指导。但是，相关方法大多缺乏在植物苗期的性别鉴定，且由于鉴定环境的不同，会出现稳定性和重复性方面的局限性。近年来，分子标记技术广泛地应用于鉴别雌雄异株植物的研究当中。在番木瓜[12]、蛇皮果[13]、银杏[14]、芦笋[15]、罗汉果[16]、山杨[17]等植物中都已经发现与性别相关的特异性条带。其中，SRAP 标记由于多态性强、标记分布均匀、重复性强、引物合成费用较低的特点，广泛地应用于遗传多样性分析、物种鉴定以及遗传图谱构建等方面[18-19]，尤其是在植物的性别鉴定中更加受到研究者的青睐。吴文珊等[20]首次利用SRAP分子标记技术应用于植物性别鉴定的研究当中，在薛荔Ficus pumilaLinn 雌株中扩增出1 条多态性的片段，能够鉴定薛荔苗期的性别。王延禹等[21]利用SRAP 分子标记技术，在高山红景天雌雄株中发掘特异性的SRAP 标记，在228 个引物组合中找到了1 个引物组合可以在雌株中扩增出特异性的片段。邓传良等[22]在256 对SRAP 引物组合中筛选出50 对可以稳定扩增出特异性条带的引物组合，共扩增出671 条带，多态率36.81%，对这一研究中获得的性别相关的特异性条带，可以进行克隆及基因测序，对于葎草Humulus scandens(Lour.) Merr性染色体的演化机制有着很大的帮助。郑翠芳[23]利用SRAP 分子标记技术鉴别了爱玉子Ficus pumilaLinn. var.awkeotsang(Makino) Corner雌雄株的性别。而有关滇杨SRAP 分子标记鉴定性别的文献国内外未见报道。

本研究以已知性别的滇杨雌雄株为材料，利用SRAP 标记技术，寻找与滇杨性别相关的分子标记，并将所获得的SRAP 标记联合运用，对未知性别滇杨幼苗进行性别鉴定，以检验鉴定结果的准确度。研究结果有望对滇杨雌株濒危机制的进一步完善和保护滇杨这一物种的完整性提供理论依据和实践指导，同时也可以为滇杨遗传改良及合理利用提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验材料共计90 份，60 份已知性别滇杨植株，分别采自云南省昆明市、香格里拉市、大理市、禄劝县（表1）。采样时，选取无病虫害的当年生滇杨枝条，将枝条采回后水培。待枝条长出新鲜叶片后，直接提取新鲜叶片DNA。雄株采集30 个样品，记作X1 ～X30，雌株采取30 个样品，记作C1 ～C30。30 株未知性别滇杨幼苗随机采自云南大理市。

表1 滇杨个体地理位置信息Table 1 individual geographic location information of Populus yunnanensis Dode

1.2 方 法

1.2.1 DNA 的提取及检测

采用Ezup 柱式植物基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司）提取其基因组DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶对DNA 进行电泳检测质量，用超微量紫外分光光度计测量其浓度。最后稀释至50 ng/µL 保存在-20 ℃的冰箱中，备用。

1.2.2 SRAP-PCR 扩增反应体系与程序

滇杨PCR 反应体系：总体积为25 µL，其中Forward Primers（ 正向引物）、Reverse Primers（反向引物）、模版 DNA 各为 1 µL，9.5 µL 的ddH2O，12.5 µL 的 2×Taq Master Mix。其反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，37 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5 个循环；94 ℃变性1 min，50 ～54 ℃（因引物而异）退火1 min，72 ℃延伸 1 min，35 个循环；72 ℃延伸 8 min，于4 ℃保存。

1.2.3 引物筛选

查阅有关植物进行性别鉴定的相关文献，挑选出符合条件的20 对SRAP[6,22,24-25]标记（表2）（上海生工生物工程有限公司合成），采用1.2.2 中反应体系和程序进行SRAP 引物的初筛和复筛。

初筛时，选取滇杨雌雄植株各10 株（其中，香格里拉市雌雄各4 株，其他地点雌雄各2 株），以其DNA 作为模版DNA，以PCR 扩增后在1%的琼脂糖凝胶电泳上检测。选择可以扩增出条带并且清晰明亮的SRAP引物作为复筛引物。复筛时，以上述60 株已知性别滇杨DNA 为模板，以PCR扩增后，在8%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行引物的复筛，找到可在所有雌雄株中扩增出特异性条带的SRAP 引物，即滇杨性别相关的SRAP 标记。

1.2.4 滇杨苗期鉴定

利用上述所筛选的SRAP 标记对30 株滇杨幼苗性别进行鉴定，比对鉴定结果的一致性程度。

2 结果与分析

2.1 滇杨DNA 提取

DNA 提取以后，使用0.8%的琼脂糖凝胶可以直观地显示DNA 提取结果，提取质量优质的DNA 在凝胶成像系统下显示的图像是明亮、无拖带的亮带（图1）。

2.2 SRAP 引物的初筛

由20 对SRAP 引物扩增后的产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行初步结果检测，结果显示：在20对引物中，有3 对引物能够在PCR 中成功的扩增出产物。3 对引物分别是Me1、Me10 和Me12（图2 ～ 3）。

2.3 SRAP 引物的复筛

将琼脂糖检测筛选出来的3 对引物使用变性的聚丙烯酰胺凝胶进行检测。检测结果显示，引物Me1 在60 株滇杨雌雄样品间扩增出明显的差异条带，根据DNA Maker 所提供的信息，这条特异性的条带均为雄性滇杨所特有，大小在1 600 bp左右。部分结果见图4。

此外，引物Me12 未在所有雌雄株间扩增出差异条带。最终在20 对SRAP 引物中找到2 对引物，可以对60 株已知性别的滇杨进行准确鉴别，分别是 ME1、ME10。

表2 滇杨20 对SAPR 引物序列信息Table 2 Sequence information of the 20SRAP primers for Populus yunnanensis Dode

图1 部分DNA 质量检测Fig. 1 Partial image of DNA quality detection

2.4 未知性别苗期滇杨鉴定结果

用筛选到的2 对SRAP 分子标记对检测了30株滇杨幼苗的DNA，结果表明，所获得的2 对SRAP 标记对未知性别滇杨的性别鉴定结果完全一致，且雌雄比例均为2:13（图6 ～7）。初步认为，所获得的引物可以对未知性别的苗期滇杨进行早期性别鉴定。

同样，引物Me10 也在所有雄性样品中出现特异条带，约在710 bp 左右。部分结果如图5 所示。

图2 SRAP 引物Me1 和Me10 琼脂糖凝胶检测结果Fig. 2 Agarose gel test result of SRAP primer Me1 and Me10

图3 SRAP 引物Me12 琼脂糖凝胶检测结果Fig. 3 Agarose gel test result of SRAP primer Me12

图4 Me1 与部分样品扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶Fig. 4 Modified polyacrylamide gel image of partial amplification product on Me1

图5 Me10 部分扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶图像Fig. 5 Modified polyacrylamide gel image of partial amplification product on Me10

图6 Me1 检测未知性别滇杨结果图像Fig. 6 Result image of unknown gender detection of Populus yunnanensis Dode on Me1

图7 Me10 检测未知性别滇杨结果Fig. 7 Result of unknown gender detection of Populus yunnanensis Dode on Me10

3 讨 论

利用分子标记对植物进行性别鉴定，一直是近年来的研究热点问题之一。

王洪梅等[17]对96 个山杨个体（雌雄各48 个）在26 对SSR 引物中进行特异性的引物筛选，最终引物BPCA90 可以成功鉴别山杨的性别，进行PCR 反应如果检测到长度为550 bp 的单一片段则为雄性，反之若未出现，则为雌性。侯万伟等[26]利用RAPD 分子标记技术筛选与毛白杨性别相关的分子标记，在88 条随机引物中找到1 条引物S60 可以在雄株中扩增出一条1 800 bp 左右的特异性条带，表明了毛白杨雌雄株之间存在基因水平上面的差异。有国外学者用来自多个国家的68 个白杨P.tomentosa个体（37 个雄株，31 个雌株）作为材料，选择其中34 个白杨个体进行混合测序，发现了杨树同源物具有雄性特异性，通过PCR 和RT-PCR 的分析，找到了TOZ19 这个特异性的标记，这个特异性的标记可以在山杨未开花之前确定山杨幼苗的性别[27]。Geraldes 等[28]研究了52 株黑杨P. nigra和 34 株钻天杨P. nigravar. italica(Moench)Koehne 已知性别的植株，通过SNP 分子标记方法，发现了其中650 个SNP 的位点和它们的性别具有关系。相关研究人员通过RAPD 分子标记技术结合BSA 技术，确定了与雌雄异株毛白杨的性别决定相关的标记[29]。本研究所用SRAP 分子标记引物分别参考了对植物进行性别鉴定的相关文献[6,22,24-25]，从中筛选到20 对SRAP 引物。经过初筛和复筛，最终筛选到2 对可以与滇杨雄株扩增出特异性片段的引物（Me1 和Me10）。研究表明，利用Me1 这1 对引物对苦瓜雌雄进行性别鉴定，可在雄株中可以扩增出一条特异性片段[25]；而利用Me10 这1 对引物组合，同样可在葎草雄株中可以扩增出4 条雄性特异性条带[22]。相同SRAP 标记引物可在不同植物间找到与性别相关的差异条带，这表明了与植物性别相关的SRAP 引物在不同植物当中存在着一定的通用性。可见，SRAP 标记为植物的性别早期鉴定提供了一种可靠、经济又便捷的新途径。

通常情况下，自然界中植物的性别比例一般为雌:雄=1:1。然而，受植物自身内外环境的影响，其性别往往表现出一定的偏倚，有时这种偏倚相当明显，甚至导致某一性别植物濒临灭绝。Grant等[30]通过研究发现在科罗拉多州的美洲山杨的雌雄比例会随着海拔的变化而发生变化，随着海拔的升高，雌性个体的数量会减少。Zhang 等[31]对青杨P. cathayanaRehd 幼苗进行低温处理，发现低温胁迫会引起叶绿体的降解，雌株中叶绿体降解的更加严重。此外，温度的降低也会引起雌株中POD 活性的降低，导致雌株存活率降低。对美国犹他州5 个属的5 种雌雄异株植物调查后发现，在干旱的地方，雄株存活率更高，而在当地的湿润地区雌株更多。一般来说，在湿润及养分充足的地方，雌株较多，而在干旱、生存环境差的条件下，雄株往往比雌株具有更强的适应能力[32]。滇杨现有群体大多数以雄株组成，罕见雌株。有可能由于雌株对外界环境的变化反应比较敏感，致使其在生长过程中，逐渐夭亡。这一观点目前也只是一种推测。本研究筛选出的2 对SRAP 引物都可以在滇杨雄株上产生特异标记。在后期试验的检测过程中，还利用已筛选获得的与滇杨性别相关的SSR 标记引物，对30 株幼苗进行了鉴定，结果与SRAP 引物鉴定结果完全一致。可见，本研究所得的2 对SRAP 标记对滇杨性别进行鉴定是可行且准确的。另外，30 株未知性别滇杨幼苗的雌雄株比例的鉴定结果均为2:13，表现出雌株明显少于雄株。

由于滇杨雌株的稀缺，滇杨幼苗很难找到。因此，本研究仅对30 株滇杨幼苗进行了早期鉴定。此外，2 种鉴定结果均表明雌株明显少于雄株，这一现象是否与滇杨雌株濒危的原因有关，有待更多试验内容及结果的进一步阐明。

4 结 论

利用SRAP 分子标记技术，以60 株已知性别滇杨雌雄株为材料，在20 对SRAP 引物中筛选出2 对引物具有雄性特异性条带。其中，1 对引物可在1 600 bp 处扩增出条带，另1 对扩增条带则在710 bp 处。利用这2 对雄性相关的SRAP 标记引物，对30 株滇杨幼苗进行性别鉴定和结果一致性比较发现，2 对引物均能对30 株幼苗的性别进行鉴定，且鉴定结果均为雌:雄=2:13，鉴定结果完全一致。可以认为，试验所筛选出的2 对SRAP 分子标记引物，可以准确对滇杨早期性别进行鉴定。研究结果可为滇杨不同性别植株的分别利用提供早期选择，也可为雌株濒危的原因提供理论参考。