基于ICP-MS的拟穴青蟹蜕壳期前后蟹肉Ca2+、Mg2+浓度变化研究

周冬仁 林锋 孙博弈 盛鹏程 高晟 郝贵杰 叶雪平

摘要：采用石墨微波消解技术处理拟穴青蟹（ Scylla paramamosain）蟹肉样品，ICP-MS同时测定Ca、Mg两种元素，标准曲线相关系数均≥0.995，前处理耗时短，消解效果良好。结果表明，拟穴青蟹在硬壳期时体内Ca2+、Mg2+平均含量为471、2 508 mg/kg，而蜕壳后分别为385、1 565mg/kg，拟穴青蟹蜕壳前后Mg2+浓度差异不显著、Ca2+浓度差异显著。因此，为使拟穴青蟹生长过程中甲壳顺利蜕壳及硬化，建议在养殖池中合理补充Ca2+、Mg2+。

关键词：拟穴青蟹（Scylla paramamosain）;Ca2+;Mg2+;电感耦合等离子体一质谱

中图分类号：S968.25+1

文献标识码：A

文章编号：0439-8114（ 2020）12-0114-03

01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.12.025

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

青蟹属（Scylla）隶属于甲壳纲（Crustacea）十足目（Decapoda]短尾亚目（Brachyura）梭子蟹科（Por-tunidae），分为锯缘青蟹（Scylla serrata）、紫螯青蟹（ Scylla tranquebarica）、拟穴青蟹（Scylla paramamo-sain）、榄绿青蟹（Scylla olivacea）4个种，分布于东南亚、澳大利亚、日本、印度、南非等海域。2012年，中国青蟹总产量达24万t，其中青蟹养殖总产量达17万t，占当年全球青蟹产量的73.5%，是世界最大的青蟹养殖国。浙江省是中国的青蟹养殖大省，青蟹养殖产量占全国的30%。浙江省青蟹养殖主要集中在三门县，2016年该县青蟹养殖面积达5 467hm2，产量达1.28万t，占浙江省同类青蟹总产量的1/3，占全国青蟹总产量的1/5。

根据浙江省水生动物疫病监控与流行病学调查分析，褪壳不遂症是影响青蟹产量的重要原因之一。蜕壳对甲壳动物的生长和发育具有重要的作用，许多学者进行了相关研究，如Hartonll[研究认为水质是影响甲壳动物生长和蜕壳最重要的环境因素之一;朱春华等[2]报道了养殖水体中Ca2+与Mg2+含量对南美白对虾生长的影响;曾朝曙等[3]、王洪全等[4]与赵云龙等[5]分别报道了水温对锯缘青蟹、红螯螯虾和中华绒螯蟹等甲壳类水生动物胚胎发育的影响;岳立芳等‘61研究了养殖池塘中C a2+浓度对远海梭子蟹软壳持续时间及形态变化的影响;谢达祥等[7]报道了Ca2+与Mg2+浓度对凡纳滨对虾糠虾幼体育成仔虾成活和生长的影响;黄根东[8]从养殖实际出发阐述了补钙在虾蟹养殖中的重要性。国内外学者研究了水质、水温等因素对甲壳动物生长和发育的影响，但青蟹蜕壳期前后蟹体Ca2+、Mg2+浓度变化方面还未有详细报道。

电感耦合等离子体一质谱（ Inductively CoupledPlasma-Mass Spectrometry，ICP-MS）从20世纪80年代发展起来元素分析测试技术。与传统无机分析技术相比，该法具有检出限低、灵敏度高、分析速度快、动态分析范围宽、分析精度高、能同时分析多个元素等优点[9]。本研究以浙江省三门县某拟穴青蟹养殖场采集蜕壳期前后的青蟹为研究对象，利用石墨消解法对蟹肉进行前处理，建立了ICP-MS测定拟穴青蟹蟹体内C a2+、Mg2+浓度，以期对养殖过程中补充Ca2+、Mg2+的时间阶段及必要性提供理论支撑，为进一步研究拟穴青蟹蜕壳期生长、蜕壳与Ca2+、Mg2+濃度的关系及相关疾病的发生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验对象

拟穴青蟹采自浙江省三门县绿洋特种水产养殖专业合作社，该批次样品采样期为2018年7月中旬，处于某次拟穴青蟹蜕壳初期。同一个养殖池，规格为40-50g，未蜕壳青蟹（硬壳）6只，蜕壳期青蟹（软壳）6只，同时在养殖池的下风口中上层采集养殖用水。

壳硬度的划分，壳的硬度划分为2个等级：硬壳蟹表示代表拟穴青蟹壳完全硬化，与未蜕壳前差别不大，用手按无凹坑出现;软壳蟹代表拟穴青蟹蜕壳24 h内，壳非常软，用手指轻轻一按，即可现出一凹坑，然后凹坑慢慢弹回，整只蟹可以直接食用。

1.2主要仪器及试剂

NexION 2000型电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS），SPB 50-48型石墨消解系统，珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司;SECURA125-1CN/SQP型电子天平，赛多利斯（上海）贸易有限公司;超纯水系统。

UP级硝酸，苏州晶瑞化学股份有限公司;调谐液Ba、Bi、Ce、Co、In、Li、U 1.0 g/L，珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司;

1.3 样品前处理

拟穴青蟹取肉、均质后放人塑料袋中，-20℃保存。样品解冻后称取1.0 g（精确到0.000 1g），将样品放入50 mL离心管中，加入5mL硝酸，静置过夜后，将离心管拧紧后反旋一圈，放人石墨消解系统，100℃加热th，取出冷却，用去离子水多次冲洗离心管并将溶液定容于50 mL容量瓶即为试样溶液。同时，制备试样空白溶液。

1.4 试验条件及工作参数

ICP-MS需要排除干扰，采用在标准模式（STD）下使用调谐液来调谐仪器，来降低质谱干扰，其中最关键的氧化物干扰（ Ce0 155.9/Ce 139.905≤0.035）实测值0.019，双电荷干扰（Ce++ 69.9527/Ce 139.905≤0.035）实测值0.023，表明仪器状态良好。

采用在线内标方法监测和校正基体效应，减少非质谱干扰，24Mg.40Ca的内标为45Sc，检测模式选择碰撞模式（KED）进一步使结果更准确。由于Ca在同位素质量数为43时在仪器中能有良好的响应，并且干扰少，所以采用43作为Ca的检测质量目标，同理Mg选择24为检测质量目标。氩气流速0.9psi，质谱扫描数目设置为20，读数重复3次自动取平均值。

仪器背景等效浓度BEC分别为-0.026 115、0.000 269 μg/L，仪器检测限DL分别为16.416 972、0.205 280 μg/L，均能达到较低的程度。两条标准曲线的相关系数≥0.995，具有良好的相关性，可以用于对样品进行进一步计算及分析。

2 结果与分析

经ICP-MS检测可知所采样品拟穴青蟹未蜕壳（硬壳蟹）蟹体中Mg2+浓度分别为612、436、413、427、357、601 mg/kg，Ca2+浓度分别为3 139、1 933、2 009、2 059、2 827、3 079mg/kg。蜕壳期青蟹（软壳）Mg2+浓度分别为261、409、570、248、301、519 mg/kg，C a2+浓度分别为667、1 867、1 737、1 796、1 208、2 113mg/kg（表1）。养殖用水中Mg2+浓度为439 mg/kg、Ca2+浓度为132 mg/kg。

对Mg2+、Ca2+浓度用SAS软件采用合并方差（ Pooled）的t检验进行分析，结果如表2、表3所示。拟穴青蟹蜕壳前后Mg2+浓度差异不显著、Ca2+浓度差异显著。虽然Mg2+浓度差异不显著，但从其平均值来看，硬壳蟹的Mg2+浓度比软壳蟹的浓度高23.3%。

3 小结与讨论

本试验采用石墨微波消解技术处理蟹肉样品，前处理耗时短，消解效果良好。使用ICP-MS同时测定Ca、Mg两种元素，采用自动调谐优化仪器参数降低质谱干扰，在线内标减少非質谱干扰，定量分析方法检出限低，其准确度和精确度高，Ca、Mg元素标准曲线相关系数均≥0.995，具有良好的相关性，适用于测定蟹肉中元素的含量。

青蟹在硬壳期时体内Ca2+、Mg2+含量浓度较高，Mg2+平均含量为474 mg/kg.Ca2+平均含量2 508 mg/kg，而蜕壳后分别为385、1 564 mg/kg，说明青蟹在蜕壳后将大量消耗机体内的C a2+、Mg“用于甲壳的硬化。虾蟹等甲壳类动物因为其特殊的生理构造，生长过程中需要吸收大量的Ca2+、Mg“来满足生长需要，而Ca2+、Mg2+吸收不足又会导致虾蟹甲壳不能正常硬化，形成软壳病或者脱壳不遂，生长速度减慢，严重影响甲壳类水生动物的产量[10]。而中国目前集约化的养殖方式又常使水体中矿物质盐的含量严重不足[11]。青蟹是广盐性的海产蟹，养殖水体中Ca2+、Mg2+浓度较高，日常养殖过程中在水体中需要补充C a2+、Mg2+的频率不如淡水养殖那么迫切，但在试验中发现青蟹蜕壳前后，蟹体内的Ca2+、Mg2+浓度差别较大，其中Ca2+浓度差异显著，硬壳蟹体内Ca2+浓度比软壳蟹高60.26%，虽然Mg“浓度差异不显著，但硬壳蟹比软壳蟹的浓度高22.3%。侯文杰等[12]研究认为在养殖水环境中添加Mg盐与Ca盐，不仅可提高成活率，而且有利于满足对虾体内Ca2+、Mg2+的需求，有利于甲壳硬化及蜕壳。因此，在养殖过程中，为了使青蟹顺利蜕壳及蜕壳后快速生长，在蜕壳前3-5 d在养殖池塘中补充Ca“、Mg2+。拟穴青蟹养殖在盐度为0.5%-3.3%的沿海地带，养殖水中的钙镁浓度没有海水高，从试验养殖场抽取的水中C a2+、Mg2+浓度仅有132、439 mg/kg，而一般海水中Ca2+、Mg2+浓度达412及1 295 mg/kg，因此养殖过程有必要补充Ca“、Mg2+[13，14]。

参考文献：

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基金项目：浙江省科技厅重点研发项目（2018C02019）

作者简介：周冬仁（1980-），男，江苏江阴人，高级工程师，主要从事渔业环境与安全，（电话）13567287353（电子信箱）872559718@qq.com;通信作者，叶雪平，推广研究员，（电子信箱）yxp 900@sina.com。