陈继铭 吴晓静 刘田丰 陈海聪 黄成硕
(广东医科大学附属医院骨科中心,广东湛江, 524023)
草次酸是甘草中天然产物甘草酸的三萜苷元成分[1,2]。甘草次酸的药理作用有:抗炎[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、抗病毒[6]、保肝[7]和促进胰岛素吸收[8]等。甘草次酸在抗炎护肝作用中均显示出较好活性[9-11]。甘草次酸有显著的抗氧化作用,可抑制四氯化碳生成游离基及过氧化脂质[12-14]。甘草次酸可通过增强Nrf2核转录及下游目的基因调控,缓解四氯化碳皮下注射诱导小鼠肝纤维化的作用,从而影响体内氧化和抗氧化系统的平衡[15]。另外,四氯化碳对小鼠致肝损伤的动物模型可造成骨质疏松,其原因可能与肝受损不能合成某些蛋白或是细胞因子有关[16]。本实验建立四氯化碳致小鼠肝损伤的动物模型,观察甘草次酸在护肝的同时,是否具有预防四氯化碳致小鼠肝损伤后出现的骨丢失作用,为其应用于临床防治肝性骨病提供基础。
1.1.1 实验动物
24只普通级昆明种10周龄的小白鼠,体质量(32.42±4.27)g,雌雄各半。购买于南方医科大学实验动物中心,动物质量合格证为:SCXK(粤)2013-0002。
1.1.2 实验药物、实验仪器与试剂
药物:甘草次酸(西安富捷药业有限公司,20160930);四氯化碳(天津市大茂化学试剂厂,分析纯),用食用花生调和油配制成40%(体积分数)的四氯化碳油溶液。
实验仪器:赛多利斯BT 25S电子天平(德国Sartorius);Micro CT仪(SCANCO Medical AG,型号viva CT40);Eppendorf 5415R小型高速冷冻离心机(德国Eppendorf)。
试剂:谷丙转氨酶测定试剂盒(ALT)和丙二醛测试盒(MDA),均购于南京建成生物工程研究所。
小鼠按体重随机分成3组,每组8只。具体为(1)对照组(CON):皮下注射0.1mL/10g花生油,每5d注射一次,首剂加倍,灌胃10ml/kg/d蒸馏水;(2)模型组(MOD):皮下注射0.1mL/10g的40%(体积分数)四氯化碳花生油溶液,每5d注射1次,首剂加倍,灌胃10ml/kg/d蒸馏水;(3)甘草次酸(GA):按模型组同法造模,灌胃50mg/kg/d甘草次酸。动物饲养环境相同,自由饮水及进食,每隔一周称1次体重。实验连续四周,于结束前一天禁食12h,后摘眼球取血,分离血清测定ALT;取肝脏称重并制备肝匀浆测MDA;取右侧胫骨进行Micro CT扫描。
1.3.1 小鼠肝脏系数的计算[16]
肝脏系数=肝脏重量(g)/小鼠体重(g)×100%。
1.3.2 血清ALT活性的检测
小鼠血样3000r/min离心10min,取血清,按试剂盒说明测定。
1.3.3 肝匀浆MDA活性的检测
称取肝脏相同部位0.2g,用1.8mL冷生理盐水制10%肝匀浆,按试剂盒说明测定。
1.3.4 胫骨Micro CT检测
小鼠胫骨Micro CT扫描[16]:电流114μA,电压70kVp,扫描时间为24.8min,间隔时间为200ms,分辨率为中度。进行角度为180?倖的投射,对同一样品扫描获得500张不同截面的1024×1024像素的图片,对于胫骨选取距生长板远端1mm,层厚2mm的骨组织为兴趣区域进行三维重建。经分析得到参数[17]:骨体积分数(BV/TV),骨小梁数量(Tb.N),骨小梁分离度(Tb.Sp),骨小梁厚度(Tb.Th),骨组织矿物密度(BMD)、连接密度(Con.D)、结构模型指数(SMI)以及各向异性的程度(DA)。
如表1所示,实验结束时,CON组小鼠实验后体重增加8.54%,MOD组小鼠实验后体重增加0.36%,GA组小鼠实验后体重增加6.91%。
表1 小鼠体重的变化
如表2所示,与CON组比较,MOD组小鼠肝脏指数增加了31.78%(P<0.05)。与MOD组相比,GA组的肝脏指数明显下降15.43%(P<0.01)。
表2 小鼠肝脏指数的变化
如表3所示,与CON组比较,MOD组小鼠ALT和MDA活性均明显升高,分别升高了209.91%(P<0.01)、83.65%(P<0.05)。与MOD组相比,GA组的ALT和MDA活性均明显降低,分别降低了79.41%(P<0.05)、46.58%(P<0.05)。
表3 小鼠肝匀浆MDA的变化
如表4和5所示,与CON组比较,MOD组小鼠BV/TV、Tb.N、DA、Conn.D、BMD明显降低,分别降低了46.15%(P<0.01)、56.52%(P<0.01)、23.61%(P<0.01)、72.23%(P<0.01)、56.62%(P<0.05);Tb.Sp、SMI明显增加,分别增加了216.67%(P<0.05)、49.28%(P<0.01)。与MOD组相比,GA组小鼠BMD明显增加,增加了102.58%(P<0.01)。
表4 小鼠胫骨骨微结构参数的变化
表5 各组小鼠Micro CT参数的变化
与CON组比较,MOD组小鼠骨小梁数目减少、断裂、变短,中央区域出现很大的空腔。与MOD组相比,GA组小鼠骨小梁数目增多,骨小梁链接较为紧密,而且出现的网状结构较为明显,骨微观结构保持完整。见图1。
(注:CON为对照组,MOD为模型组,GA为甘草次酸组。SEG图反映骨小梁的数量)图1 小鼠胫骨Micro CT三维SEG图
四氯化碳经细胞色素P450代谢可引起细胞膜发生脂质过氧化反应,破坏细胞膜,致使肝细胞变性坏死[18]。因肝细胞受损导致血清中ALT和AST的活性显著升高;而MDA含量可反映肝损伤的严重程度[19]。本实验中,与CON组比较,MOD组小鼠肝脏指数、ALT和MDA活性明显增加,说明四氯化碳可造成小鼠肝损伤。与MOD组相比,GA组小鼠肝脏指数、ALT和MDA活性明显下降,提示四氯化碳可致肝损伤,血液中ALT含量增加,引发体内MDA含量的提高,经甘草次酸给药,对肝脏有一定程度的保护作用,血液中ALT与肝脏中MDA含量减少。甘草次酸可能减少MDA含量,可增强内源性氧自由基清除系统的功能,防止或减轻肝脏的损伤,从而发挥保护作用[9]。
Micro CT扫描可较大程度克服骨组织形态计量学测量方面存在的问题,成为研究骨微观结构的新技术,是研究骨形态学的理想工具[20]。本实验中,与CON组比较,MOD组小鼠胫骨BV/TV、Tb.N、DA、Conn.D、BMD明显降低,Tb.Sp、SMI明显增加;三维图显示骨小梁数目减少变短、断裂,中央区域出现很大的空腔,说明腹腔注射四氯化碳可造成小鼠出现骨量丢失严重,且骨微结构严重被破坏。可能是肝受损后不能合成影响体内激素、细胞因子和有毒物质的相关蛋白或是细胞因子,从而影响骨代谢[16]。而与MOD组相比,GA组小鼠胫骨BMD明显增加,BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D数值上均有增加;Tb.Sp、DA、SMI数值上均有减少,但差异均无统计学意义;三维图显示骨小梁数目增加,骨小梁紧密连接,网状结构较较明显,保持较完整的骨微观结构。甘草次酸有很强清除-OH及O2-自由基的作用,可能通过氧化应激途径缓解四氯化碳致小鼠骨丢失[21],另外甘草次酸具有雌激素样作用,且其雌激素样作用可能是ER介导产生的[22],具体机制有待下一步研究。