网果酸模HPLC指纹图谱研究

严光俊 许京 王瑞海 苗青 郭昌洪 张维 刘丽梅

蓼科酸模属植物网果酸模RumexchalepensisMill.(又名红丝酸模)的干燥根及根茎，地方临床药用称之为金不换，始载于《中药志》，主要分布在湖北、江西、河南、浙江及安徽等地[1-4]，其具有清热解毒、通便、杀虫之功效，民间用于止血和治疗痢疾[5]。

网果酸模为地方草药，多为栽培品，有关网果酸模化学成分报道较少[6-8]，有效成分报道仅有酸模素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等，有限的几个成分很难全面概括或评价其质量[9]。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的色谱鉴定手段，该技术已被广泛用于中药的质量控制领域，因其可较全面地反映中药材及植物药产品的药效学物质特征，评价其稳定性及一致性而受到国际的认可[10-11]，目前，未见有网果酸模HPLC指纹图谱相关报道。故本实验运用中药指纹图谱技术，首次建立了网果酸模HPLC指纹图谱，使用相似度对不同地块、不同采收年限、不同采收季节网果酸模样品进行分析，为网果酸模质量标准的建立提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100系列，包括G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G1315B DAD检测器，HP化学工作站。Agilent Extend- C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm，美国安捷伦)，SB-5200DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，CP2202S电子天平(瑞士梅特勒-托利多)。

1.2 药物与试剂

大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号：PS010712)、酸模素对照品(批号：PS170608-03)、大黄素对照品(批号：PS000259)、大黄酚对照品(批号：PS010475)、大黄素甲醚对照品(批号：PS000263)均购自成都普思科技股份有限公司。大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品(批号：AF8032001)购自成都埃法生物科技有限公司。

乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯(Fisher 公司)，其他试剂均为分析纯，水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

16批网果酸模采自湖北省荆州市公安县章庄铺镇，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为网果酸模，去掉根茎残基，根及根茎洗净，切片，阴干，得其饮片。具体信息见表1。

表1 16批湖北省荆州市章庄铺镇网果酸模采样信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，254 nm波长处二极管阵列检测器检测，流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～40分钟，35%→60%A；40～65分钟，60%→95%A；65～70分钟，95%→100%A)，流速1 mL/分钟，柱温为室温，进样量为5 μL，分析时间为70分钟。该条件下得到的网果酸模指纹图谱色谱峰多且分离度好。见图1。

2.2 对照品溶液的制备

取大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品2.08 mg、大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品2.49 mg、大黄素甲醚对照品2.51 mg分别置于10 mL容量瓶中；酸模素对照品3.03 mg、大黄素对照品2.09 mg、大黄酚对照品2.61 mg分别于5 mL量瓶中，精密称定，加适量二氯甲烷溶解，加甲醇分别制成每1 mL含大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、酸模素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别为208 μg、249 μg、251 μg、606 μg、418 μg和522 μg的溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取网果酸模粉末(过50目筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40 mL，称定重量，超声1小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一份供试品溶液(S1)，在“2.1”项色谱条件下进样6 次，以酸模素为参照峰，各共有峰相对保留时间及相对峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)均小于5%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液(S1)，在“2.1”项色谱条件下于 0、2、4、8、12、24小时进样，以酸模素为参照峰，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均<5%，表明24 小时内供试品溶液的成分是稳定的。

2.4.3 重复性试验 取同一批样品(S1)，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，以酸模素为参照峰，各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均<5%，表明重复性良好。

2.5 参照峰的选择

酸模素色谱峰(4号峰)为所有样品中共有，而且与相邻峰分离度良好，出峰时间适中，峰面积较大，故选择其作为参照峰。

2.6 网果酸模指纹图谱的建立

2.6.1 相似度分析 将16批样品以 AIA 格式依次导入至国家药典委员会 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2008版” 软件，以 S8 为参照图谱，时间窗口设置为0.10，经多点校正和数据匹配，以中位数法生成对照指纹图谱(图2)，平均相似度为91.3%

2.6.2 共有峰标定及化学成分指认 精密吸取对照品、供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定。将对照品、样品的色谱峰保留时间及色谱图进行分析，指认了其中6种成分，分别为大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷(2号)、大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷(3号)、酸模素(6号)、大黄素(8号)、大黄酚(9号)、大黄素甲醚(10号)，具体见图2。

图1 网果酸模HPLC色谱图

注： 2号峰:大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷;3号峰:大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷; 6号峰:酸模素;8号峰:大黄素;9号峰:大黄酚;10号峰:大黄素甲醚。

2.6.3 不同地块样品指纹图谱分析 将“1号”“2号”“3号”地块样品以 AIA 格式依次导入至国家药典委员会 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2008版”软件，计算不同地块网果酸模指纹图谱相似度，结果见表2。

表2 不同地块网果酸模指纹图谱相似度计算结果

2.6.4 不同生长年限指纹图谱分析 将1年生、 2年生、 3年生样品以 AIA 格式依次导入至国家药典委员会 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2008版”软件，计算不同年限网果酸模指纹图谱相似度，结果见表3。

表3 不同年限网果酸模指纹图谱相似度计算结果

2.6.5 不同采收季节样品指纹图谱分析 将春季、秋季样品以 AIA 格式依次导入至国家药典委员会 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2008版”软件，计算不同采收季节网果酸模指纹图谱相似度，结果见表4。

表4 不同采收季节网果酸模指纹图谱相似度计算结果

3 讨论

通过对提取方法(超声、回流提取)、不同的提取溶剂和提取时间的考察，并结合有关文献确定了本节“2.3”项下供试品溶液的制备方法。

通过对色谱柱、流动相、检测波长的考察，发现本节“2.1”项下HPLC色谱条件下指纹图谱信息量最大，且各色谱峰分离较好。

通过计算相似度并进行分析，对比分析不同地块、不同年限、不同采收季节的网果酸模HPLC指纹图谱。结果显示2号地块相似度97.4%、3号地块相似度94.2%、1号地块相似度92.3%，尽管这三个地块均在湖北省荆州市公安县章庄铺镇，但三块地指纹图谱相似度还是有一定差异，说明网果酸模生态环境影响其相似度。网果酸模随生长年限增加，共有峰减少，相似度呈减少趋势，2年生相似度较低，可能与样品量少有关；网果酸模春季采收其指纹图谱相似度略高于秋季采收，说明春季采挖对于保证其质量更有利。

本实验建立了16批次网果酸模HPLC指纹图谱，平均相似度>90%，不同地块、不同年限、不同采收季节网果酸模HPLC指纹图谱，虽有差异，但相似度均>90%。

综上所述，实验所建立网果酸模HPLC指纹图谱可为网果酸模质量控制提供科学依据。