超声对小麦蛋白水解物美拉德反应进程的影响

（湖北大学知行学院，湖北武汉 430011）

小麦是西方饮食中常见的谷物，是蛋白质的重要来源。近年来，小麦蛋白水解后生成的一些功能性多肽，如色氨酸、酪氨酸等，具有良好的抗氧化性、抑菌性、乳化性等功能特性[1-2]。但小麦蛋白水解相关产物存在一些问题，产物的抗氧化能力远远低于合成抗氧化剂的抗氧化能力。因此，需要寻求一种有效安全的方法提高蛋白质的功能特性。大量研究发现，美拉德反应产物如类黑素、中间物质、还原酮，具有良好的抗氧化效果。然而，KIM等认为美拉德反应易受到内部因素（如pH值、温度、时间等）以及外部环境因素（如微波、超声等）的影响[3]。环境因素对美拉德反应进程中产物形成的影响已经引起广泛的关注。

现阶段，关于超声的研究已经引起广泛的关注，超声波可以改善各种食品的化学、物理和功能特性。超声被定义为频率大于20 kHz的一种安全且环保的高频声波。超声波目前被认为是研究和评估这些生物分子行为的有用工具，其中超声技术可以改善蛋白质功能性。值得注意的是，超声波在改善美拉德反应产物功能性质方面有许多报道。STANIC等研究发现，超声作用对蛋白质与不同种类多糖的美拉德反应产物具有一定的促进作用[4]，能增强产物的抗氧化作用，但目前的研究主要集中在超声作用对于蛋白质美拉德反应过程的影响，而关于超声对蛋白质水解物美拉德反应的研究还未见报道。本文以小麦蛋白水解物为原料，研究超声对小麦蛋白水解物美拉德反应进程影响，测定美拉德反应褐变程度、中间产物变化、接枝度、产物荧光强度、内源性荧光强度以及紫外吸收光谱等指标，以期为开发食品中天然抗氧化剂提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦蛋白（蛋白质含量≥75%）：广州千胜精细化工有限公司；葡萄糖：安徽生物科技有限公司；碱性蛋白酶（100 000 U/g～200 000 U/g）：美国 Sigma公司；甲醇、硼砂、β-巯基乙醇、邻苯二甲醛、8-苯胺-1-萘磺酸（均为分析纯）：上海颖心实验室设备有限公司。

1.2 仪器与设备

JD500-2型电子天平：上海五久自动化设备有限公司；GL-21M型冷冻离心机：上海赫田科学仪器有限公司；UT-1800型紫外可见光分光光度计：北京华旭世纪科技有限公司；DK-8B型电热恒温水浴锅：上海浦予工业科技有限公司；JY-92-ⅡN型超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；JB-2型恒温磁力搅拌器：常州荣华仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小麦蛋白水解物的制备

称量一定质量的小麦蛋白粉，配制成60 mg/mL的小麦蛋白溶液，磁力搅拌4 h。加入碱性蛋白酶（酶与底物浓度质量比为1∶50），45℃水浴水解2 h，缓慢加入1 mol/L的NaOH溶液保持pH值约为8.0。然后于95℃水中加热10 min，冰浴冷却使其达到25℃，最后用1 mol/L的HCl调pH值至7.0。将得到的水解物进行冷冻干燥得到冻干粉，使用双缩脲方法测定蛋白水解物的含量，以便后期试验使用。

1.3.2 小麦蛋白水解物的美拉德反应产物

将小麦蛋白水解物配制成30 mg/mL的溶液，与30 mg/mL葡萄糖溶液按照1∶1的质量比进行混合，磁力搅拌使其完全溶解，调节混合溶液的pH值至8.0，于95℃水浴锅加热180 min，超声功率为300 W，时间为 0、20、40、60、80 min，冷却至 25℃。

1.3.3 中间产物以及褐变程度分析

将样品调至蛋白质浓度为2mg/mL，分别在294 nm和420 nm处测量其吸光值。

1.3.4 接枝度测定

参照KIM等的方法并略作改动[5]。将样品用去离子水稀释至蛋白浓度为2 mg/mL，取200 μL样品于10 mL离心管中，加入4 mL的邻苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）溶液，充分混匀，于35℃水浴加热2min，冷却至25℃，340 nm处测其吸光值。

1.3.5 表面疏水性测定

将样品稀释成蛋白质浓度分别为1.00、0.75、0.5、0.25 mg/mL，将2 mL样品与10 μL的8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）溶液混匀，在370 nm激发波长下测定其荧光强度。

1.3.6 荧光光谱分析

参照LI等的方法并略作调整[6]。将样品稀释成蛋白浓度为1 mg/mL。反应产物的激发波长为347 nm，扫描范围为370 nm～550 nm；内源性荧光光谱的激发波长为280 nm，扫描范围为300 nm～400 nm，狭缝宽度为5 nm。

1.3.7 紫外光谱分析

将样品稀释至蛋白质浓度为1 mg/mL。紫外扫描光谱范围200 nm～350 nm。

1.4 统计分析

每个试验重复进行3次。数据统计分析采用Statistix 8.1（分析软件St Paul，MN）软件包中Linear Models程序进行，差异显著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 12.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 褐变程度变化

超声时间对小麦蛋白水解物的美拉德反应褐变程度、中间产物以及接枝度的影响见表1。

表1 超声时间对小麦蛋白水解物的美拉德反应褐变程度、中间产物以及接枝度的影响Table 1 Effects of ultrasonic time on browning degree，intermediate product and graft degree of wheat proteolytic protein in Maillard reaction

小麦蛋白水解物和多糖加热条件下发生美拉德反应，但美拉德反应过程经常出现褐变，这可能是由于美拉德反应的高级阶段形成一种棕色的物质，称为类黑精。根据这些物质在420 nm的吸光值来确定其褐变程度。由表1可知，随着超声时间的增加，褐变程度呈现先逐渐升高后逐渐降低的趋势（P＜0.05）。当超声时间为40 min时，褐变程度最大。表明超声作用破坏多肽的三级以及四级结构，从而产生更多的游离氨基酸。李晓东等研究发现类黑精含有短链氨基酸序列，具有良好的抗氧化效果[7]。随着超声时间的继续延长，可能超声作用造成蛋白水解物的结构过度伸展，使得多肽的活性降低，因此不利于美拉德反应的进行。

2.2 中间产物和接枝度变化

美拉德反应过程中，糖类物质会裂解产生一些无色的酮类及醛类小分子，我们可以根据294 nm下的吸光值判断其中间产物的多少。由表1可知，随着超声时间的增加，294 nm处的吸光值出现先升高后下降的趋势（P＜0.05）。随着超声时间的增加，多肽结构完全被打开，内部固有的氨基基团被暴露。美拉德反应过程中游离氨基的数量通过计算可以得到接枝度，因此接枝度可以用来反映美拉德反应的程度。由表1可以看到，随着超声时间的延长，接枝度显著增加，超声时间为40 min时，接枝度达到最大值，为16.8%（P＜0.05）。BYCKOW等研究发现超声作用可能导致小麦蛋白水解物内部更多的亲水性氨基酸游离出来，同时超声可以引起局部相对平移运动可能使得反应基团相互靠近，因此导致蛋白质水解物的氨基与多糖的糖基共价交联，增加美拉德反应速度[8]。超声时间过长导致小分子肽的聚集，并且此结果与褐变程度以及中间产物结果一致。

2.3 表面疏水性分析

超声时间对小麦蛋白水解物的美拉德反应表面疏水性的影响如图1所示。

图1 超声时间对小麦蛋白水解物的美拉德反应表面疏水性的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on the surface hydrophobicity of wheat protein hydrolysates in Maillard reaction

经过超声处理后，样品的表面疏水性增加，这与前面内源性荧光光谱的结果一致。随着超声时间的增加，由于超声具有一定的空穴作用，暴露更多的疏水性氨基酸残基，因而导致表面疏水性的增加。但是超声时间过长导致蛋白质分子电荷重新分布，内部的氨基酸残基发生聚集折叠现象导致疏水性氨基酸无法暴露出来，隐藏在分子内部。

2.4 荧光光谱分析

超声时间对小麦蛋白水解物的美拉德反应产物荧光光谱的影响如图2所示。

由图2（A）可知，超声前期，美拉德反应产物的荧光强度呈现逐渐增加趋势，超声时间为40 min时，荧光强度达到最大值。这可能是由于多肽表面部分氨基酸残基暴露，并且在美拉德反应过程中移向更加亲水的微环境。然而，当超声时间超过40 min，荧光强度呈现降低的趋势，这归因于与多肽结合的多糖链的屏蔽效应。此外，最大的荧光发射波长处于420 nm～440 nm范围内，这与美拉德发光荧光体的特征波长一致。

图2 超声时间对小麦蛋白水解物的美拉德反应产物荧光光谱的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on fluorescence spectra of Maillard reaction products of wheat proteolytic products

内源性荧光光谱可以用来反映芳香族氨基酸（主要是色氨酸和酪氨酸）荧光强度的变化，从而间接反映蛋白质三级结构的变化，进而反映美拉德反应进行的程度。由图2（B）可知，与为超声的样品相比，超声显著降低了内源性荧光光谱的强度。随着时间的增加，荧光光谱逐渐升高，在40 min时达到最大值，然后逐渐降低。说明超声时间导致蛋白水解物的构象发生一定的变化，芳香族氨基酸暴露在更加亲水的环境中，特征吸收峰改变，引起荧光淬灭。然而，过度的超声时间处理导致多肽发生去折叠现象，导致荧光强度增加。

2.5 紫外吸收光谱分析

超声时间对小麦蛋白水解物的美拉德反应紫外光谱的影响如图3所示。

图3 超声时间对小麦蛋白水解物的美拉德反应紫外光谱的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on ultraviolet absorption spectrum of Maillard reaction of wheat protein hydrolysate

随着超声时间的增加，紫外吸收值先呈现逐渐增加的趋势，表明席夫碱的生成量逐渐增加。超声波使得一些氨基酸残基如芳香族氨基酸的空间结构发生改变，暴露更多的发光基团，导致紫外吸光值的增加。YU等研究发现，一些氨基酸如精氨酸与葡萄糖美拉德反应产物的吸收峰有两个，分别是265 nm和215 nm[9]。这与我们的研究结果不一致，可能有蛋白水解物有关。

3 结论

超声处理可以改善小麦蛋白水解物美拉德反应的进程，其产物均高于非超声对照组。超声40 min时，美拉德反应的褐变程度、中间产物以及接枝度均具有最大值，但是随着超声时间的进一步增加，由于蛋白质聚集导致其美拉德反应速率降低，产物生成量降低。另外，荧光光谱、紫外光谱以及表面疏水性也充分证明其多肽结构的变化，从而影响美拉德反应的进行。因此，控制超声时间在40 min内，可提高美拉德反应的速率，进而提高其功能特性。