基于网络药理学的活血荣络方对脑梗死血管新生作用机制研究

杨仁义，刘利娟，康蕾，颜思阳，谭惠中，傅馨莹，尹倩，周德生

基于网络药理学的活血荣络方对脑梗死血管新生作用机制研究

杨仁义1，刘利娟2，康蕾1，颜思阳1，谭惠中1，傅馨莹1，尹倩1，周德生2

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

采用网络药理学方法研究活血荣络方在脑梗死血管新生中的作用及其机制。通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）收集活血荣络方的主要活性成分并进行初步筛选，采用Swiss Target Prediction数据库预测主要活性成分靶点，通过GeneCards数据库预测脑梗死血管新生作用靶点，二者取交集得出共同靶点。采用String数据库及Cytoscape软件Network analyzer功能构建共同靶点蛋白相互作用网络。采用DAVID数据库结合Cytoscape软件对共同靶点进行GO及KEGG富集分析。收集并筛选出活血荣络方422个活性成分、1028个靶点，脑梗死血管新生169个靶点，共同靶点42个，其中IL6、TNF、AKT1、CASP3相互作用最明显，主要调控氧化应激、细胞凋亡、蛋白磷酸化、内皮细胞及平滑肌细胞增殖等生物过程及HIF-1信号通路、癌症途径、TNF信号通路、能量代谢途径、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路等。活血荣络方在脑梗死血管新生中体现了多成分、多靶点、多途径的作用特点，有助于进一步诠释活血荣络方的药理学作用机制。

活血荣络方；网络药理学；脑梗死；血管新生

中国疾病预防控制中心与美国健康测量和评价研究所的合作调查研究显示，在282类致死原因中，中风是2017年中国人十大死亡原因之一[1]。缺血性中风（脑梗死）以风、火、痰、血、气、虚为因，病性属本虚标实，以肝肾阴虚为本，以瘀、痰为标。肝肾亏虚，气血津液不足，致脉络失养，血行不畅，瘀血阻滞于内，发为中风，故而阴虚血瘀阻滞脑络是脑梗死的关键病机之一。中医学根据“血管”形态及功能将其表述为“脉”“血脉”“血络”“脉络”等。《血证论》有“然又非去瘀是一事，生新另是一事也。盖瘀血去则新血已生，新血生而瘀血自去，其间初无间隔”，指出血管内“祛瘀”与“新生”共存，瘀去则“生血”“生脉”。吴以岭等[2]提出“营卫承制调平”理论之“脉络-血管系统病”，认为缺血区微血管结构及功能保护本质是“脉络-血管系统”的自稳态，故而阴虚血瘀阻滞脑络致瘀塞失养在治疗上祛瘀新生并存，调节“脉络-血管系统”自稳态环节可使脑络血管新生。

活血荣络方是湖南中医药大学第一附属医院神经内科根据多年临床经验，结合缺血性中风阴虚血瘀阻滞脑络病机制定的协定方，具有养阴生津、活血养血、舒筋活络通脉功效，由鸡血藤、石楠藤、生地黄、玄参、黄精、乳香、没药、川芎按6∶6∶3∶2∶3∶2∶2∶2比例组成。方中鸡血藤、石楠藤为君，两者相须为用，加强活血补血、舒筋活络之功；生地黄、玄参、黄精为臣，养阴补血、滋脾胃、益精补髓，可除寒热、调气机，助君药活血补血，又可补肾益脾养真阴，标本兼治；乳香、没药最善活络通经、化瘀止痛，可加强君药活血之力，并使气机畅达，为佐；川芎气颇芳烈，而味不甚厚，以气用事，升发之力殊猛，能上达头目，直透巅顶，又质不坚、多空窍，故可旁行肢节、贯通脉络、透达腠理、开泄肌肤，为血中之气药，上下内外无所不达，可引诸药直达病所，为使药。诸药合用，可养阴活血、化瘀通络，标本兼治，气血兼调，对缺血性中风阴虚血瘀证颇为有效。

为进一步揭示活血荣络方在脑梗死血管新生中的作用机制，本研究利用网络药理学方法，探讨活血荣络方中君药之一鸡血藤、臣药之一黄精、佐药之一乳香及使药川芎共同促进脑梗死血管新生的作用靶点及相关通路，为进一步开发活血荣络方并揭示其作用机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分收集与筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[3]收集活血荣络方中鸡血藤、黄精、乳香、川芎的主要化学成分。根据人体对药物吸收、分布、代谢及排泄/毒性的药动学参数[4]，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）[5]≥30%、类药性（drug likeness，DL）[6]≥0.18、血脑屏障（blood brain barrier，BBB）≥-0.3为筛选条件[7]，初步筛选出方中具有较高活性的化合物。

1.2 作用靶点预测与共同靶点筛选

通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）[8]及ChemSpider数据库（http://www. chemspider.com/）[9]收集和校对活血荣络方候选化合物名称，将化合物成分信息以3D结构保存为SDF或MOL格式。将各候选化合物输入Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction. ch/）[10]对相关靶点进行预测，并将物种设定为智人（Homo sapiens），剔除无化学结构、靶点化合物，并利用UniProt数据库（https://www.uniprot. org/）[11]对靶点名称规范化。

通过GeneCards数据库（https://www.genecards. org/），以“Brain Ischemia（MeSH）”AND“Angiogenesis”为检索词，收集脑梗死血管新生的作用靶点，以Score≥30为限定条件进行筛选[12]。

通过Bioinformatics Gent（http://bioinformatics. psb.ugent.be/beg）中Van de Peer Lab取交集，获得活血荣络方活性成分与脑梗死血管新生的共同靶点，并绘制韦恩图。

1.3 共同靶点蛋白相互作用网络构建

将共同靶点导入String数据库（https://string-db. org/）[13]，选择Multiple Protein，限定物种为Homo sapiens，设定最低要求互动分数为中度信度0.400[14]，得到蛋白相互作用（PPI）相关信息。将PPI相关信息中的Node1、Node2、Combined score值导入Cytoscape3.7.1进行可视化，并利用Network analyzer功能对PPI网络图进行拓扑分析，根据Degree值对共有靶点进行筛选分析。

1.4 共同靶点GO富集分析

通过DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）[15]对共同靶点进行GO富集分析。共同靶点以“OFFICIAL GENE SYMBOL”格式导入，设定“Background”为“Homo sapiens”，＜0.05，分别导出细胞组分（CC）、分子功能（MF）、生物过程（BP）进行GO分析。对值取负对数，值越小，-lgP值越大，表明富集程度越大。

1.5 共同靶点KEGG通路富集分析

通过DAVID数据库对共同靶点进行KEGG富集分析，基本设置同“1.4”项。对排名前20的通路与其涉及靶点构建靶点-通路网络图，将导出的KEGG通路相关信息中“Term”“Genes”“-lgP”值导入Cytoscape3.7.1进行可视化，导出Degree值。

2 结果

2.1 活血荣络方活性成分

通过TCMSP共收集活血荣络方化合物422个，其中鸡血藤68个、黄精38个、乳香127个、川芎189个。筛选出符合条件的化合物35个，其中鸡血藤14个、黄精7个、乳香8个、川芎6个，将其作为候选化合物，见表1。

表1 活血荣络方中候选化合物基本信息

归属药物MOL ID化合物名称OB/%BBBDL 鸡血藤MOL000296hederagenin36.910.960.75 MOL000033(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R,5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]- 2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol36.231.090.78 MOL000358beta-sitosterol36.910.990.75 MOL000392formononetin69.670.020.21 MOL000449stigmasterol43.831.000.76 MOL0004688-o-Methylreyusi70.320.020.27 MOL0004693-Hydroxystigmast-5-en-7-one40.930.450.78 MOL000483(Z)-3-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]acrylamide118.35-0.270.26 MOL000491augelicin37.500.300.66 MOL000493campesterol37.580.930.71 MOL000497licochalcone a40.79-0.210.29 MOL000500vestitol74.660.300.21 MOL000506lupinidine61.891.700.21 MOL000507psi-Baptigenin70.12-0.270.31 黄精MOL001792DFV32.76-0.290.18 MOL004941(2R)-7-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one71.12-0.250.18 MOL002714baicalein33.52-0.050.21 MOL0063314',5-dihydroxyflavone48.55-0.030.19 MOL000546diosgenin80.880.270.81 MOL000359sitosterol36.910.870.75 MOL000358beta-sitosterol36.910.990.75 乳香MOL001215tirucallol42.121.070.75 MOL001241O-acetyl-α-boswellic acid42.730.410.70 MOL0012433alpha-Hydroxy-olean-12-en-24-oic-acid39.320.200.75 MOL001255boswellic acid39.550.240.75 MOL0012633-oxo-tirucallic,acid42.86-0.060.81 MOL001265acetyl-alpha-boswellic acid42.730.280.70 MOL001272incensole45.591.200.22 MOL001295phyllocladene33.402.100.27 川芎MOL001494mandenol42.001.140.19 MOL002135myricanone40.60-0.080.51 MOL002140perlolyrine65.950.150.27 MOL002151senkyunone47.660.500.24 MOL002157wallichilide42.310.730.71 MOL000359sitosterol36.910.870.75

2.2 活血荣络方作用靶点

剔除无化学结构及无靶点化合物（MOL000033、MOL000483、MOL000491、MOL004941、MOL001241、MOL001295、MOL002140），得到活血荣络方候选化合物共1028个靶点，其中鸡血藤303个、黄精240个、乳香171个、川芎314个。通过GeneCards数据库收集并筛选到脑梗死血管新生靶点169个。取交集后获得活血荣络方候选化合物与脑梗死血管新生的共同靶点共42个，韦恩图见图1，具体靶点见表2。

注：Disease.脑梗死血管新生；JXT.鸡血藤；HJ.黄精；RX.乳香；CX.川芎

表2 活血荣络方候选化合物与脑梗死血管新生共同靶点

项目个数靶点 CX Disease HJ JXT RX5HMGCR、NOS2、PPARG、PTGS2、ACHE CX Disease HJ JXT2JAK2、MMP9 CX Disease HJ RX1MMP2 Disease HJ JXT5XDH、PIK3CA、ADORA1、PDGFRB、APP Disease HJ JXT RX1MAPK1 CX Disease HJ3KDR、BCL2、PARP1 Disease RX1PSEN1 CX Disease RX3HIF1A、F2、AGTR1 Disease JXT6PON1、TNF、F3、LIMK1、IL6、CASP3 Disease HJ7TTR、NTRK2、MAPT、MTOR、AKT1、IL1B、REN CX Disease7FLT1、TEK、ICAM1、KNG1、SELE、STAT3、SLC2A1 CX Disease JXT1BRAF

注：Disease.脑梗死血管新生；JXT.鸡血藤；HJ.黄精；RX.乳香；CX.川芎

2.3 共同靶点蛋白相互作用网络

共同靶点蛋白PPI网络见图2。根据Degree值设定节点大小。Degree值越大，节点越大；Combine score值越大，边线颜色越深且越粗。该网络图中共有40个靶点（HMGCR、PON1无相互作用），包含41个节点、352条边。靶点的Degree值见表3，其中IL6（Degree＝35）、TNF（Degree＝34）、AKT1（Degree＝33）、CASP3（Degree＝32）。表明活血荣络方可能通过多个靶点在脑梗死血管新生中发挥作用。

表3 活血荣络方候选化合物与脑梗死血管新生共同靶点蛋白Degree值

靶点Degree 靶点Degree 靶点Degree 靶点Degree IL635 MMP223 FLT117 PARP111 TNF34 MTOR22 REN17 PSEN110 AKT133 APP22 SELE17 NTRK28 CASP332 ICAM122 KNG116 MAPT8 PTGS227 HIF1A21 NOS215 BCL27 MAPK126 F219 F314 TTR7 MMP926 PPARG19 PDGFRB13 ADORA17 STAT325 PIK3CA18 TEK12 BRAF5 IL1B25 AGTR118 SLC2A112 XDH3 KDR23 JAK217 ACHE12 LIMK11

2.4 共同靶点GO富集分析结果

42个共同靶点GO富集分析得到198个BP、26个CC、27个MF，对值取负对数，-lgP值越大表明富集程度越大，富集程度居前10位的条目见图3。分析结果显示，共同靶点主要分布于细胞外基质、细胞质膜，细胞质等细胞成分中，通过蛋白质结合、酶结合、受体结合、ATP结合、生长因子结合等方式，参与一氧化氮生物合成、蛋白质磷酸化、平滑肌细胞增殖、凋亡的调控、PI3K信号传导、肽基丝氨酸磷酸化、蛋白质自磷酸化、ERK1和ERK2级联、内皮细胞增殖、激活参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性等生物进程。

2.5 共同靶点KEGG通路富集分析结果

42个共同靶点KEGG富集分析得到83个信号通路，靶点-通路网络图见图4。富集程度前20位的通路见表4。共同靶点参与的关键通路为HIF-1信号通路、癌症途径、TNF信号通路、能量代谢途径、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路等。

图3 活血荣络方候选化合物与脑梗死血管新生共同靶点GO富集分析

注：菱形代表信号通路，长方形代表共同靶点

表4 活血荣络方候选化合物与脑梗死血管新生共同靶点KEGG通路富集分析结果

信号通路-lgP 信号通路-lgP HIF-1 signaling pathway11.58 PI3K-Akt signaling pathway4.82 Pathways in cancer11.08 mTOR signaling pathway4.78 TNF signaling pathway 9.63 Chagas disease （American trypanosomiasis）4.65 Proteoglycans in cancer 8.11 Colorectal cancer4.64 Hepatitis B 5.94 Insulin resistance4.55 Central carbon metabolism in cancer 5.88 Glioma4.54 Toxoplasmosis 5.65 Renal cell carcinoma4.51 Tuberculosis 5.29 African trypanosomiasis4.49 Prostate cancer 5.07 Adipocytokine signaling pathway4.38 Acute myeloid leukemia 4.86 Leishmaniasis4.35

3 讨论

荣气是气、血、精、津、液、神、髓、膏等一切精微物质的总称。脑梗死之“荣气虚滞”病机理论源于阴虚血瘀阻滞脑络学说，主要包括荣气虚与荣气滞两方面[16]，表现为脏腑亏虚和内生之邪。基于荣气理论及脑梗死“荣气虚滞”病机特征，虚中夹滞者当以补虚为主，而荣气虚主要包括精血、气阴、津液的亏损，故治以滋补精血、养阴益气、化生津液的柔药为主；以滞为主者当以通滞为要，荣气滞主要表现为脑络不通，治以行气通络，自古医家多“以藤通络”。活血荣络法以滋阴活血为主，在滋阴基础上结合脏腑病位联合补气、补血、补精等，活血基础上配伍理气、化痰、清热、泻实等，佐以开窍。根据临床辨证情况，调整各种亚治法的组合方式及补泻权重。活血荣络方根据针对脑梗死“阴虚血瘀阻络-荣气虚滞”病机制定，具有养阴生津、活血养血、舒筋活络通脉功效。

网络药理学整合了多学科技术，可从整体角度揭示药物、靶点、疾病之间的关系，为中药作用靶点、途径提供数据支撑，广泛应用于单味中药、中药药对及中药复方作用机制研究[17]。分子网络相互作用即利用基因、蛋白质、RNA、DNA等生物分子，以网络形式构建整体的生命体，并通过其相互作用完成机体生命过程。中医学整体观念强调人体自身整体性及内外环境整体性，将局部病变与整体病变统一起来，与分子网络相互作用对疾病诊治思想不谋而合。分子网络相互作用的稳态是机体健康的物质基础，单个或多个生物分子结构功能失调，使整体处于失衡状态，从而导致机体疾病的发生[18]。本研究基于网络药理学方法，从分子网络相互作用角度，结合中医学整体观念的特点，挖掘活血荣络方的活性成分，探讨其对脑梗死血管新生的作用机制，为临床使用提供依据。

本研究通过对活血荣络方中君药鸡血藤、臣药黄精、佐药乳香、使药川芎的活性成分进行收集、筛选，得到422个活性成分，部分活性成分已被证实在脑缺血再灌注损伤中具有神经保护作用，芒柄花素（formononetin）能通过下调脑缺血/再灌注大鼠Bax/Bcl-2比值及上调PI3K/Akt信号传导途径，从而发挥神经保护作用[19]。黄芩素（baicalein）在缺血性脑损伤中可调控PTEN/Akt通路保护受损神经元[20]。进一步对活性成分靶点预测，得出1028个对应的潜在靶点，体现了活血荣络方的整体协同作用机制。同时，基于数据库检索得到脑梗死血管新生的169个相关靶点，利用韦恩图交叉筛选出活血荣络方与脑梗死血管新生的42个共同作用靶点。前期研究显示活血荣络方能通过肿瘤坏死因子（TNF）、基质金属蛋白酶-9、JAK2、STAT3、白细胞介素（IL）-1β、Caveolin-1、乙酰胆碱酯酶、胆碱转移酶等靶点在脑梗死血管新生中发挥作用[21-24]。脑梗死血管新生实验表明，IL-6能介导负免疫调节促神经血管生成[25]。活血荣络方中单药具有多成分、多靶点作用特点，与脑梗死血管新生靶点的重叠程度较大，从微观角度证实活血荣络方可能通过共有靶点在脑梗死血管新生中发挥作用。

共同靶点PPI网络表明，活血荣络方的靶蛋白与脑梗死血管新生靶蛋白具有复杂的相互作用网络关系。活血荣络方主要通过炎症因子、肿瘤坏死因子、趋化因子、转录因子、多种酶等物质之间相互作用，从而在脑梗死血管新生中发挥作用，与前期实验研究结果[23-24，26]相吻合。脑缺血再灌注损伤后趋化因子CXCL12在CXCR4/CXCR7受体单元中发挥作用[27]，从而促进血管新生。因此，这些靶点共同作用、相互调节可能是活血荣络方发挥其治疗作用的机制。

GO富集分析结果表明，活血荣络方的作用靶点分布在多种细胞组分中，能多靶点、多结构、多形式地参与生物进程，涉及氧化应激、细胞凋亡、蛋白磷酸化、内皮细胞及平滑肌细胞增殖等。这些生物进程在一定程度上能够促进脑梗死血管新生作用[28]。Ma等[29]研究表明，曲克芦丁和脑蛋白水解物注射液（TCHI）通过氧化应激途径并促进血管生成减轻脑缺血损伤。Gu等[30]研究发现，Intelectin-1在脑梗死血管新生细胞凋亡途径中发挥重要作用，通过Akt-eNOS信号通路，使Akt蛋白磷酸化，从而促进内皮细胞增殖功能及血管新生。脑梗死发生时，血液供应障碍致脑组织缺血缺氧，在低氧状态下，血管内皮生长因子（VEGF）表达上调[31]，通过多种途径保护血管内皮，促进内皮细胞增生，改善大脑微循环，促进侧支循环建立，从而改善缺血区域炎症及氧化应激反应，最终起到神经保护作用。因此，活血荣络方可能通过多靶点、多形式地参与多种生物学进程，在脑梗死血管新生中起到保护作用。

KEGG通路富集分析结果表明，活血荣络方的作用通路主要涉及HIF-1信号通路、癌症途径、TNF信号通路、能量代谢途径、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路等。Liu等[32]发现，小檗碱能激活HIF-1/VEGF信号通路，在脑梗死血管新生中发挥作用。Xue等[33]通过体外研究发现，双过氧化钒可上调HIF-1α/VEGF通路，抑制PTEN促进Akt磷酸化，从而增强脑梗死血管新生作用。TNF在缺血组织中表达，并能促进血管生成。Huang等[34]发现，脑梗死血管生成与TNF信号通路中TNFR1介导的α5β1和αVβ3整联蛋白上调有关。PI3K-Akt信号通路是通过PI3K磷酸化下游蛋白介导下游反应发挥作用的，Akt能介导血管内皮细胞生长，磷酸化的Akt（p-Akt）是促血管新生最强生物因子，主要通过激活内皮型一氧化氮合酶，从而增加血管通透性，促血管重塑及扩张，使血管内皮细胞增殖、迁移、代谢，同时p-Akt能高表达缺氧诱导因子（HIF-1）、VEGF等血管生成因子，促进血管新生[35]。Chen等[36]研究发现，人参皂苷Rg1通过PI3K/Akt/mTOR通路增加HIF-1α和VEGF的表达，从而促进脑梗死血管新生。

脑梗死发生时，低氧状态能诱导HIF-1信号通路引起血管内皮细胞活性氧簇增加，加重氧化应激反应，使能量代谢障碍，致蛋白质磷酸化[37]，并且能通过TNF激活癌症途径，介导炎症反应相关因子如IL-6等表达水平升高，同时TNF及IL-6等能诱导内皮细胞黏附因子表达，诱导细胞凋亡、细胞自噬。因此，活血荣络方在脑梗死血管新生中起保护作用的机制可能是通过HIF-1α/VEGF通路、TNF信号通路、PI3K/Akt/mTOR通路调控氧化应激途径、炎症反应、能量代谢途径、细胞凋亡及自噬等程序性死亡模式、趋化因子途径等共同发挥作用。

综上所述，本研究基于网络药理学分析活血荣络方在脑梗死血管新生中的作用，预测其活性成分及共同靶点，分析可能作用机制，初步揭示其在脑梗死血管新生中的保护作用及其作用机制，可为进一步相关研究及开发提供依据。

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Study on Mechanism ofPrescription in Angiogenesis of Cerebral Infarction Based on Network Pharmacology

YANG Renyi1, LIU Lijuan2, KANG Lei1, YAN Siyang1, TAN Huizhong1, FU Xinying1, YIN Qian1, ZHOU Desheng2

To study the role and mechanism ofPrescription in angiogenesis of cerebral infarction by network pharmacology.The main active components ofPrescription were collected and screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). The Swiss Target Prediction database was used to predict the main active component targets, and the target of angiogenesis in cerebral infarction was predicted by GeneCards database, and the common targets were screened and integrated. A common target PPI network was constructed using String database and Cytoscape software Network analyzer function. GO and KEGG enrichment analysis were performed on the common target using DAVID database combined with Cytoscape software.Totally 422 active components ofPrescription, 1028 targets, 169 targets for angiogenesis in cerebral infarction, and 42 common targets were screened, among which IL6, TNF, AKT1 and CASP3 were most obviously interacted, mainly regulating oxidative stress, apoptosis, protein phosphorylation, endothelial cells and smooth muscle cell proliferation and other biological processes, and HIF-1 signaling pathway, cancer pathway, TNF signaling pathway, energy metabolism pathway, PI3K-Akt signaling pathway, and mTOR signaling pathway.Prescription demonstrates the characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway in angiogenesis of cerebral infarction, which is helpful to further interpret the pharmacological mechanism ofPrescription.

Prescription; network pharmacology; cerebral infarction; angiogenesis

R277.733.3；R285.5

A

1005-5304(2020)08-0098-08

10.3969/j.issn.1005-5304.201907340

国家自然科学基金（81874463）；湖南省科技计划（2017SK4005）；湖南省中医药科研计划（201824、2020045）；湖南省财政中医药项目（rsk-010-13[006-09]）

周德生，E-mail：2478020529@qq.com

（2019-07-22）

（2019-08-19；编辑：陈静）